[发明专利]人工优化的双亚基苯酚羟化酶基因及其应用

说明书

本发明公开了一种优化后适用于大肠杆菌表达的苯酚羟化酶基因序列及其应用。编码的苯酚羟化酶由两个亚基组成，每个亚基都由独立的T7启动子和终止子控制，其核苷酸序列分别如SEQ ID No 1和SEQ ID No 2所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列分别如SEQ ID No 3和SEQ ID No 4所示。本发明优化合成的基因能够在大肠杆菌中成功表达，可用于制备降解苯酚的微生物。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及结构优化的苯酚羟化酶基因序列。

技术背景

苯酚是一种用途广泛的重要有机化工原料。它主要用于生产酚醛树脂、双酚A、己内酰胺、己二酸、苯胺、烷基酚以及水杨酸等，此外，还可用作溶剂、试剂和消毒剂等，在合成纤维、合成橡胶、塑料、医药、农药、香料、染料以及涂料等方面有广泛的应用。预计未来几年，随着我国环氧树脂和聚碳酸酯在电子、建材、汽车工业、通讯和计算机等领域消费量的不断增长，我国苯酚的需求量仍将稳步提高。

随着苯酚的大量生产和消费，苯酚不可避免的会通过各种途径污染地下水、地表水和土壤。苯酚对人、动物和农作物都有严重的危害。我国政府将其列入68种优先污染物名单并且明确规定饮用水中苯酚含量不得超过0.002mg/l。

微生物由于具有极强的变异性和适应性，是自然环境中降解酚类化合物的主要成员。目前，国内外发现的苯酚降解菌，主要包括细菌和真菌两大类。其中细菌主要来源于假单胞菌属(Pseudomonas sp.)，其次是芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、产碱菌属(Alcaligenssp.)和红球菌属(Rhodococcus sp.)。

苯酚羟化酶是苯酚降解途径中的关键酶，它将苯酚转变为芳香族化合物降解的一种核心代谢产物——邻苯二酚，之后再通过一些相同或相似的核心代谢途径最终为微生物所利用。苯酚羟化酶主要包括三种类型，单亚基羟化酶、双亚基羟化酶和多亚基羟化酶。单亚基苯酚羟化酶是一种黄素蛋白单加氧酶，它能够打断O₂的O-O键，将其中一个氧原子插入苯酚，另一个氧原子则被还原成水。双亚基或多亚基羟化酶至少都包括两部分，一部分是寡聚蛋白，负责苯环的羟化，另一部分是单组分铁硫黄素蛋白，负责将电子从NAD(P)H转移到加氧酶上。有的羟化酶中还具有调控前两个组分相互感应的组分。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种能在大肠杆菌的表达的苯酚酚羟化酶基因。不同于Rhodococcus erythropolis野生型苯酚羟化酶基因操纵子表达模式（AJ973228.1），本发明只保留苯酚羟化酶的两个亚基的编码序列，并分别连接上独立的T7启动子和终止子调控其表达。同时优化编码区基因结构，遵循以下原则：（一）优化基因密码子，提高基因翻译效率。（二）消除基因内部的常用限制性内切酶的识别位点，便于表达盒构建。（三）消除逆向重复序列、茎环结构和转录终止信号，使基因内部的GC/AT均衡，提高RNA的稳定性。（四）使基因编码蛋白符合N端原则，以提高翻译蛋白的稳定性。（五）优化mRNA二级结构自由能，以提高基因表达效率。值得指出的是，本发明对密码子的优化同时还兼顾了植物的密码子偏爱。

所述经优化的苯酚羟化酶亚基pheA1的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。所述经优化的苯酚羟化酶亚基pheA2的核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。每个基因两端分别边上T7启动子与终止子，完整序列两端分别连接EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点，全长序列由南京金斯瑞公司合成（参见图1）。

将合成的基因片段经EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切后，连入相同酶切的载体pET-28a，得到重组质粒pET-PH，并将其转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到阳性株系。