[发明专利]一种GH36族α-半乳糖苷转移酶合成Globotriose的方法

权利要求书

1.一种GH36族α-半乳糖苷转移酶合成Globotriose的方法，其特征在于，包括如下步骤：将GH36族α-半乳糖苷转移酶、乳糖、肌醇半乳糖苷和缓冲液，充分混合均匀，形成酶促反应体系，反应体系内，GH36族α-半乳糖苷转移酶的终浓度为0.2～0.5U/mL，乳糖的终浓度为5～25mM，肌醇半乳糖苷的终浓度为5～15mM，所述的缓冲液是pH=6.0~8.0的McIlvainebuffer；将酶促反应体系放入恒温箱，在35～50℃下，反应1～3h，得粗产物；

所述GH36族α-半乳糖苷转移酶的制备方法包括如下步骤：

1）以水稻基因（Oryza sativa L. var. Nipponbare）的GenBank NO. BAB64768.1中的cDNA为模板，以特异性引物进行PCR扩增，获得GH36族α-半乳糖苷转移酶基因；将GH36族α-半乳糖苷转移酶基因和表达载体PET-28a进行双酶切后，连接构建重组质粒；将重组质粒转入到大肠杆菌BL-21中，获得含有GH36族α-半乳糖苷转移酶基因的重组工程菌；所述的特异性引物的核苷酸序列为：

。

2.根据权利要求1所述的一种GH36族α-半乳糖苷转移酶合成Globotriose的方法，其特征在于，还包括分离纯化步骤：将所得粗产物加热至100℃灭酶5min，离心，取上清液；将上清液脱盐；脱盐后的上清液倒入分离柱Li Chrosorb 100 NH₂柱中，按体积比，流动相为CH₃CN:H₂O=75:25，流速为1mL/min，通过制备液相方式进行分离纯化。

3.根据权利要求1或2所述的一种GH36族α-半乳糖苷转移酶合成Globotriose的方法，其特征在于，所述GH36族α-半乳糖苷转移酶的制备方法还包括如下步骤：

2）将含有GH36族α-半乳糖苷转移酶基因的重组工程菌经诱导培养表达酶蛋白；

3）收集菌体细胞，细胞超声波破碎，离心取上清液，获得粗酶液；

4）将粗酶液经一步纯化，制得GH36族α-半乳糖苷转移酶。

4.根据权利要求3所述的一种GH36族α-半乳糖苷转移酶合成Globotriose的方法，其特征在于，步骤2）具体为：将重组工程菌以1%的接种量接种于含有硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，于170~200rpm培养至初始菌密度OD600=0.3时，加入IPTG至终浓度为20~30μM，在35-40℃、170~200rpm下诱导培养24~32小时。

5.根据权利要求3所述的一种GH36族α-半乳糖苷转移酶合成Globotriose的方法，其特征在于，步骤4）具体为：纯化采用HisTrap^TMHP镍亲和柱，经亲和层析方法制得GH36族α-半乳糖苷转移酶提取液。