[发明专利]一种基于转基因技术的人工创制矮化西瓜新品种的方法

说明书

本发明涉及一种基于转基因技术的人工创制矮化西瓜新品种的方法，包括含有西瓜GlaGA20ox基因序列的RNA干扰载体及其构建方法，RNA干扰载体的构建步骤如下：根据GlaGA20ox基因序列信息，克隆获得正向序列及反向序列，将正向序列及反向序列插入DHpart27RNAiFADp1P4载体中，获得RNA干扰载体；创制矮化西瓜新品种的方法为：将RNA干扰载体转化到西瓜细胞中，并通过抗生素筛选获得阳性转化植株；利用检测引物，通过PCR技术对阳性转化植株中卡那霉素基因区域进行扩增，扩增产物连入T载体后进行DNA测序，以确认西瓜阳性植株。本发明可实现对西瓜中GlaGA20ox基因进行定点突变，获得基因功能缺失的矮化西瓜。

技术领域

本发明涉及一种RNA干扰载体、构建方法及创制矮化西瓜新品种的方法，属于转基因植物制备技术领域。

背景技术

西瓜为葫芦科作物，是世界性的瓜类蔬菜作物，西瓜年产量约为 90亿吨，具有较高的市场供应。西瓜生产上的一个重要环节是选育优良品种，其中矮化植株的选育是一个重要目标，矮化西瓜株型紧凑，无须整枝，适应密植，能充分利用土地和光照资源，可提高单位面积产量且早熟，并且能够节约劳动力，降低成本，提高经济效益。但是，目前的西瓜种质资源单一，遗传基础狭窄，利用常规杂交育种技术已经越来越耗时耗力。因此，采用新技术培育新品种是当前西瓜产业升级发展的迫切要求。

目前西瓜全基因组测序及骨干育种材料的重测序工作已经完成，大量功能基因有待验证，这对建立高效的西瓜转基因技术提出了迫切需求。但是，西瓜是公认的较难进行基因编辑的作物之一，亟需建立高效稳定的转基因西瓜的制备方法，尤其是基于转基因技术的矮化西瓜新品种的制备方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：为解决现有矮化西瓜新品种的制备方法存在的上述技术问题，提供一种RNA干扰载体、构建方法及创制矮化西瓜新品种的方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

本发明首先公开了含有西瓜GlaGA20ox基因序列的RNA干扰载体DHpart27RNAiFADp1P4-GlaGA20ox的构建方法，构建步骤如下：

根据西瓜的GlaGA20ox基因序列信息，克隆获得正向序列及反向序列，然后将克隆获得的正向序列及反向序列插入 DHpart27RNAiFADp1P4载体中，获得RNA干扰载体DHpart27RNAiFADp1P4-GlaGA20ox，所述GlaGA20ox基因序列如SEQ ID No.1所示。

优选地，所述RNA干扰载体DHpart27RNAiFADp1P4-GlaGA20ox的构建方法具体为：

选取西瓜GlaGA20ox基因的保守功能区作为RNA干扰片段，利用 PCR法将RNA干扰片段两端添加5'(HindIII)和3'(XbaI)酶切位点，得到正向序列；利用HindIII和XbaI对DHpart27RNAiFADp1P4载体和正向序列进行酶切，得到plasmid1酶切载体和酶切正向序列；将酶切正向序列连接至plasmid1酶切载体，得到重组载体；

利用PCR法将干扰片段两端添加5'(KpnI)和3'(XhoI)酶切位点，得到反向序列；利用KpnI和XhoI对重组载体和反向序列进行酶切，得到plasmid2酶切载体和酶切反向序列；将酶切反向序列连接至 plasmid2酶切载体，得到RNA干扰载体 DHpart27RNAiFADp1P4-GlaGA20ox；

所述正向序列如SEQ ID No.2所示，所述反向序列如SEQ ID No.3 所示。

优选地，制备正向序列所用的引物对为d1-F和d1-R，所述d1-F 为5’-CCCAAGCTTAAAACCTCTAGAGAATGCTCTTT-3’，所述d1-R为5’-CTAGTCTAGAGCCTCGTATTTCCTTCTCC-3’。