[发明专利]一株敲除胞外核酸酶ExeR的谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一株敲除胞外核酸酶ExeR的谷氨酸棒杆菌，该菌株中胞外核酸酶ExeR基因失活，本发明中还公开了上述敲除胞外核酸酶ExeR的谷氨酸棒杆菌的构建方法。本发明研究了敲除谷氨酸棒状杆菌中胞外核酸酶对生物膜的作用，进一步验证eDNA作为细菌生物膜中不可或缺的成分，并成功使谷氨酸棒状杆菌成膜能力加强，为后面应用连续化发酵提供实验基础。

技术领域

本发明涉及敲除胞外核酸酶ExeR的谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用，属于生物技术领域。

背景技术

生物被膜又被称为生物膜，是细菌为在环境中更好生长和繁殖的生存形式。生物膜的形成分为四个阶段：吸附，增值，成熟和分散，分散出来的细胞再次进入第一个阶段如此以往的循环，其中吸附时期分为可逆与不可逆阶段。在生物膜形成过程中细胞分泌出胞外物质，其中主要成分为蛋白、多聚糖、eDNA，这些化学成分聚合为致密的包涵体，从而促使了生物膜的形成。以往的研究表明蛋白作为支柱支撑着生物膜空间结构，多糖作为粘合剂充实整个空间，但最新研究表明eDNA是生物膜的灵魂主宰，并且从生物膜初始阶段就参与整个形成过程，无论是从时空上还是空间上，eDNA都无处不在。

已经有研究表明eDNA可以增加菌体初始对载体以及菌体自身之间的粘附，从而促使生物膜的后期形成，并且可以稳固生物膜的结构。生物膜的形成从第一批细胞到载体上就已经开始了，细胞开始分泌出DNA，DNA作为一种载体与细胞之间的粘合剂使得细胞与载体之间无法分开，接着以相同的方法拉近细胞与细胞之间的距离。随后细胞便会分泌出多糖和蛋白用来巩固DNA形成的网状结构，使生物膜不易被破坏。这三样胞外分泌物质是生物膜形成过程中不可缺少的。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一株敲除胞外核酸酶ExeR的谷氨酸棒杆菌以解决现有技术中谷氨酸棒杆菌成膜能力弱，不能用于连续化发酵的问题。

本发明还要解决的技术问题是，提供上述敲除胞外核酸酶ExeR的谷氨酸棒杆菌的构建方法。

本发明最后要解决的技术问题是，提供上述敲除胞外核酸酶ExeR的谷氨酸棒杆菌在发酵制备脯氨酸中的应用。

一株敲除胞外核酸酶ExeR的谷氨酸棒杆菌，该菌株中胞外核酸酶ExeR基因失活，所述胞外核酸酶ExeR基因失活是指该菌株中胞外核酸酶ExeR基因不能正常表达得到具有功能的胞外核酸酶ExeR。本发明中是通过缺失胞外核酸酶ExeR基因中的部分基因来使其失活，若是通过其他基因缺失或基因替换来使胞外核酸酶ExeR基因失活都在本发明的保护范围之内。

其中，所述谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒状杆菌ATCC13032。

其中，所述胞外核酸酶ExeR的基因序列如SEQ ID NO:2所示。

其中，胞外核酸酶ExeR失活后的基因序列如SEQ ID NO:3所示。

上述敲除胞外核酸酶ExeR的谷氨酸棒杆菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)构建ExeR基因打靶片段，所述打靶片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

(2)将步骤(1)得到的ExeR基因打靶片段构建到质粒上，得到重组质粒；

(3)将重组质粒转化谷氨酸棒状杆菌，通过基因重组得到敲除胞外核酸酶ExeR的谷氨酸棒杆菌。

步骤(2)中，所述质粒为pk18mobsacB。

步骤(3)中，所述谷氨酸棒状杆菌为谷氨酸棒状杆菌ATCC13032。

上述敲除胞外核酸酶ExeR的谷氨酸棒杆菌在微生物发酵中的应用。

上述敲除胞外核酸酶ExeR的谷氨酸棒杆菌在发酵制备脯氨酸中的应用。

有益效果：