[发明专利]一种建兰花叶病毒株系的克隆及其转录载体构建

权利要求书

1.一种建兰花叶病毒株系，其特征在于，所述病毒株系的全长基因组序列如SEQ IDNO:1-10所示。

2.根据权利要求1所述的一种建兰花叶病毒株系，其特征在于，所述病毒株系的5'端亚基因组序列如SEQ ID NO:11-21所示。

3.一种体外转录载体，其特征在于，所述转录载体用于转录权利要求1所述的建兰花叶病毒株系的全长基因组序列和/或权利要求2所述的建兰花叶病毒株系的5'端亚基因组。

4.根据权利要求3所述的一种体外转录载体，其特征在于，所述转录载体的序列上游为T7启动子，序列下游包含SmaⅠ酶切位点。

5.根据权利要求3所述的一种体外转录载体，其特征在于，用于构建体外转录载体的引物组包括如SEQ ID NO:22所示的正向引物和如SEQ ID NO:23所示的反向引物；其中，所述正向引物引入T7启动子序列，所述反向引物引入PolyA位点及SmaⅠ平末端酶切位点；其中，所述病毒株系的全长基因组序列的体外转录载体序列如SEQ ID NO:24所示；所述病毒株系的5'端亚基因组序列的体外转录载体序列如SEQ ID NO:25所示。

6.一种引物组合物，其特征在于，所述引物组合物用于扩增权利要求1所述的建兰花叶病毒株系的全长基因组序列和/或扩增权利要求2所述的建兰花叶病毒株系的5'端亚基因组，其特征在于，所述引物组合物包括如SEQ ID NO:26所示的正向引物、如SEQ ID NO:27所示的反向引物以及Oligo(dT)引物。

7.一种采用如权利要求6所述的引物组合物扩增建兰花叶病毒全长序列及其5'端亚基因组序列的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1)RNA的提取及逆转录合成第一链cDNA；

对样本进行取样，采用液氮冷冻，提取RNA，利用引物Oligo(dT)反转录合成第一链cDNA；

步骤2)建兰花叶病毒序列的扩增；

以步骤1)的反转录产物为模板，PCR扩增建兰花叶病毒全长及其5'端亚基因组序列；其中，PCR扩增采用的引物包括如SEQ ID NO:26所示的正向引物、如SEQ ID NO:27所示的反向引物以及Oligo(dT)引物；

步骤3)建兰花叶病毒序列连接至载体并测序；

将步骤2)中PCR扩增获得的目的片段经胶回收后，用连接酶连接到载体，并取适量的连接反应产物转化大肠杆菌感受态，待克隆长出后，挑取单克隆进行菌落PCR验证，选取阳性单克隆进行测序，测序序列导入软件进行手动拼接，获得病毒序列；

其中，所述正向引物和反向引物扩增得到如SEQ ID NO:1-10所示的建兰花叶病毒全长基因组序列；所述正向引物和oligo(dT)引物扩增得到如SEQ ID NO:11-21所示的建兰花叶病毒的5'端亚基因组序列。

8.根据权利要求7所述的扩增方法，其特征在于，所述步骤2)的PCR扩增体系中采用高保真酶KOD-Plus-Neo；所述步骤2)的PCR扩增体系的扩增程序为：94℃变性2分钟；98℃10秒；55℃30秒，68℃4分30秒，30个循环；68℃7分钟。

9.一种如权利要求1所述的建兰花叶病毒株系的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤A：体外转录载体的线性化；

权利要求3所述的体外转录载体经限制性内切酶SmaⅠ酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，确保载体被线性化完全；

步骤B：体外转录物的合成；

向步骤A中线性化完全的体外转录载体依次加入10×体外转录缓冲液、ATP、CTP、UTP、GTP、m7G(5')ppp(5')G、线性化模板、T7RNA聚合酶，37℃水浴2小时，获得转录出的单链RNA。

10.根据权利要求9所述的建兰花叶病毒株系的制备方法，其特征在于，还包括体外转录物的接种及侵染烟草验证步骤；

其中，所述体外转录物的接种包括步骤：将转录出的RNA与等体积2×GKP缓冲液混合，摩擦接种3-4周龄的本生烟叶片；

其中，所述侵染烟草验证包括步骤：提取接种病毒的本生烟的总RNA，反转录获得cDNA第一链，针对CymMV全长及5'端亚基因组共有区域设计如SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29所示序列的引物组及针对CymMV 3'端CP区域设计如SEQ ID NO:30-SEQ ID NO:31所示序列的引物组，分别进行PCR扩增，验证体外转录物的侵染活性。