[发明专利]一种制备牙髓干细胞的方法

权利要求书

1.一种制备牙髓干细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1、牙齿的采集；

S2、分离牙髓干细胞，固定住牙齿，劈开牙冠，取出牙髓，将取出的牙髓放入PBS中冲洗，然后将取出的牙髓制成1-3mm³的块状，加入0.025%-0.2%的Ⅰ型胶原酶和0.025%-0.2%的中性蛋白酶的混合液，37℃消化10min-30min，加入PBS，1000rpm-1500rpm离心弃上清，沉淀加入培养基浸润，将组织块贴到细胞培养皿中，置CO₂培养箱中培养。

2.根据权利要求1所述的制备牙髓干细胞的方法，其特征在于：在步骤S2中，培养皿中组织块与组织块间隔4-5mm，每块组织上滴培养基，所述CO₂培养箱内饱和湿度，5%CO₂，37℃。

3.根据权利要求1所述的制备牙髓干细胞的方法，其特征在于：还包括以下步骤：

S3、后期培养，4-6h后补加培养基，第3-5天继续补加培养基，第7-9天半量换液，第10-15天显微镜下观察细胞克隆情况，若细胞形态均一且数量符合预定值，需弃组织块全换液，若细胞数量不符合预定值，需继续半量换液至细胞数量符合预定值，方可弃组织块全换液，此后每2-3天换液一次。

4.根据权利要求1所述的制备牙髓干细胞的方法，其特征在于：在步骤S1中，采集后牙齿置于运输液中保存和运输，所述运输液包括以下组分：

抗菌肽 10-30ug/ml；

猪胆盐 0.3-0.8mg/ml；

氯化两面针碱 1-10ug/ml；

溶剂为PBS。

5.根据权利要求1所述的制备牙髓干细胞的方法，其特征在于：所述培养基包括以下组分：

DMEM/F12培养基 60-80%；

间充质干细胞用血清替代物 5-15%；

间充质干细胞培养上清 15-25%。

6.根据权利要求5所述的制备牙髓干细胞的方法，其特征在于：所述培养基内含有80-100U/ml的青链霉素。

7.根据权利要求5所述的制备牙髓干细胞的方法，其特征在于：所述间充质干细胞培养上清的制备方法包括以下步骤：

A1、收集细胞培养两天以上，生长状态好，融合率70%以上的细胞培养上清液；

A2、收集到的上清液2000-4000rpm离心10-20min，弃沉淀；

A3、离心后的上清液用0.22um微孔滤膜过滤。

8.根据权利要求1到7其中之一所述的制备牙髓干细胞的方法，其特征在于：所述培养皿经过明胶溶液包被，明胶溶液完全覆盖培养皿底，然后室温放置0.5-2h，弃掉明胶，用PBS洗涤，室温放置0.5-2h，所述明胶溶液包括以下组分：

明胶 0.1-2%；

其余为PBS。

9.根据权利要求8所述的制备牙髓干细胞的方法，其特征在于：所述明胶溶液高温高压蒸汽灭菌15-20min。

10.根据权利要求1到7其中之一所述的制备牙髓干细胞的方法，其特征在于：在步骤S1中，对采集的牙齿进行消毒，在超净台中取出牙齿，用酒精擦洗浸泡5min，再用含抗菌肽、猪胆盐和氯化两面针碱的PBS冲洗。