[发明专利]一种排硫硫杆菌蛋白质双向电泳分析方法

说明书

本发明涉及一种排硫硫杆菌细胞蛋白的电泳分析方法，其具体步骤如下：A.排硫硫杆菌细胞蛋白的提取，B.SDS‑PAGE凝胶的制备，C.双向凝胶电泳，D.染色处理及图像扫描。本方法操作流程清晰简单，分析效果较好，能够较好分离辨别15‑110kDa范围内的菌体蛋白，并可通过后续质谱分析得到一些蛋白的具体信息。

技术领域

本发明主要涉及微生物细胞蛋白分析，主要涉及一种排硫硫杆菌蛋白质双向电泳分析方法，通过合理的溶液配比使检测更精确。

背景技术

双向凝胶电泳由O'Farrel以及Klose和Scheele等人于1975年发明的，原理是第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离，具有相同等电点的蛋白质无论其分子大小，在电场的作用下都会用聚焦在某一特定位置即等电点处；第二向则按分子量的不同用SDS-PAGE分离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。

该技术可用于凝胶蛋白的检测，凝胶染色的目的是使其中的蛋白质能够被观察到。目前还没有通用的染色方法，只能在考虑多种因素如需要的灵敏度、线性范围、方便程度、费用、以及成像设备类型等基础上，结合实际进行选择。有时也可以将蛋白转膜后通过免疫印迹的方法来进行检测。

对于电泳结果的分析可以借助一些分析软件，成像设备可以摄入图像，对凝胶图像以数字形式保存，对每块凝胶图像进行平等的比较，在各研究组之间传递信息，并对大量的数据进行归类分析。目前应用较为广泛的图像分析软件有PDQuest、ImageMaster 2DElite、Melanie等，分辨率较高，功能齐全。尽管如此，仍不可避免约10％的未检出点和假点，需要手工添加、删除和分割。图像采集完成后。可以应用各种分析软件进行分析，可以收集、诠释、比较蛋白质组数据资料等。

一旦通过差异分析或其它方法找到感兴趣的蛋白后，就可以从凝胶中或膜上切取这些目标蛋白质作鉴定。现在绝大多数蛋白质的鉴定是通过质谱分析来完成的。近年来经过多方面改进已成为研究蛋白质组的最有使用价值的核心方法。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种排硫硫杆菌蛋白质双向电泳分析方法，有效分析排硫硫杆菌主要的细胞蛋白，为排硫硫杆菌的代谢机理分析提供基础。采用了SDS-PAGE双向凝胶电泳，通过优化溶液配比，获得更为精确清晰的谱图。

本发明的技术方案为：一种排硫硫杆菌细胞蛋白的电泳分析方法，其具体步骤如下：

A.排硫硫杆菌细胞蛋白的提取：

将冷冻保存的排硫硫杆菌培养物加入蛋白裂解液磁力搅拌得悬浮液，经超声破碎后的悬浮液，离心收集上清液，加入有机溶剂萃取，再离心得沉淀物，再加入水化液溶解，其中水化液中DTT浓度为15-25mM，测定并控制蛋白浓度为10-50μg/mL，提取的蛋白溶液样品冰箱保存备用；

B.SDS-PAGE凝胶的制备

用单体贮存液、分离胶溶液、SDS溶液、APS溶液和TEMED溶液按比例混合，制备质量体积分数为0.075-0.125g/ml SDS-PAGE凝胶；

C.双向凝胶电泳

用步骤A提取的蛋白溶液将胶条水化；将水化后的胶条安装到电泳仪中，先在100-200V条件下进行低压除盐，再调高电压至5000-7000V，进行第一向等电聚焦电泳；再将胶条平衡；将平衡后的胶条转移至步骤B配制好的SDS-PAGE凝胶的胶面上，进行第二向SDS-PAGE电泳；

D.染色处理及图像扫描：电泳完成后，凝胶使用考马斯亮蓝染色，再进行图像扫描，用计算机软件分析图像，获取详细的蛋白样品信息。

优选步骤A中所述的水化液组分为：8-10M尿素，1％-2％g/ml CHAPS，0.001-0.002％g/ml溴酚蓝，0.5-1％g/ml IPG缓冲液，15-20mM DTT；需要严格控制DTT的浓度为15-20mM。