[发明专利]一种高效降低芽孢杆菌发酵液粘度的方法

说明书

本发明属于发酵工程领域，具体涉及一种高效降低芽孢杆菌发酵液粘度的方法，其特征在于：敲除待改造菌株表达系统的eps操纵子，具体为敲除待改造菌株表达系统的eps操纵子为将扩增后eps操纵子的上游片段eps‑F插入到pBTS质粒的KpnI和BamHI之间，下游片段eps‑R插入到BamHI和XhoI之间，构建新的质粒pBTS‑eps，电转化质粒于改造菌株、培养基培养和PCR鉴定而得。本发明阻碍胞外多糖合成，进而大大降低发酵液粘度，促进发酵产物分离，降低成本，大大提高效率。

技术领域

本发明属于发酵工程领域，具体涉及一种高效降低芽孢杆菌发酵液粘度的方法。

背景技术

发酵工作完成后进行的是发酵产物的分离工作，一般通过离心、过滤的方式去除菌体，采用超滤的方式浓缩发酵产物，柱层析的方式分离发酵产物。但是发酵液的粘度会影响上述分离过程，降低工作效率，提高成本。

在中国专利201711034848.6，专利名称为一种降低芽孢杆菌发酵液粘度的方法中，通过敲除pgs基因的方式，阻止聚γ-谷氨酸的合成。其可以显著降低发酵液的粘度，促进菌体生长，提高发酵产物浓度。在发酵产物分离过程中，也显著提高了分离的效率，降低生产成本。但是，发酵液粘度还是较高，尤其是过滤和超滤过程中，膜堵塞现象非常严重。滤膜的更换周期短，过滤效率低下。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明提供一种高效降低芽孢杆菌发酵液粘度的方法，在基于Z12菌株的表达系统中，通过删除eps操纵子的全部基因，阻碍生物膜的形成，菌落生长形态发生改变，同时显著降低发酵液粘度，减少后续过滤过程中的滤膜更换次数，降低发酵产物分离的成本。

解决以上技术问题的本发明中的一种高效降低芽孢杆菌发酵液粘度的方法，其特征在于：敲除待改造菌株表达系统的eps操纵子，阻碍胞外多糖合成，进而降低发酵液粘度，促进发酵产物分离。

所述表达系统核苷酸序列如SEQ ID No.：1所示。

所述敲除待改造菌株表达系统的eps操纵子为将扩增后eps操纵子的上游片段eps-F插入到pBTS质粒的KpnI和BamHI之间，下游片段eps-R插入到BamHI和XhoI之间，构建新的质粒pBTS-eps，电转化质粒于改造菌株、培养基培养和PCR鉴定而得。

所述扩增后eps操纵子的核苷酸序列如SEQ ID No.：2所示。

所述质粒pBTS-eps核苷酸序列如SEQ ID No.：3所示。

所述母菌株Z24为△(eps),△(pgs),△(aprE),△(bpr),△(epr),△(mpr),△(nprB),△(nprE),△(vpr),xylAB::PT7-TerT7,wprA::(xylR-PxylABrpoT7)。

所述高效降低芽孢杆菌发酵液粘度的方法，具体包括以下步骤：

(1)抽提待改造菌株的DNA，通过引物扩增eps操纵子的上游片段eps-F和下游片段eps-R；

采用Toyobo的KOD-Plus-Neo酶进行扩增，扩增条件程序：94℃,2min；(94℃，30s；60℃，30s；68℃，1min)x25；72℃，2min。

(2)通过酶切，将eps-F插入到pBTS质粒的KpnI和BamHI之间，将eps-R插入到BamHI和XhoI之间，构建新的质粒pBTS-eps。

(3)通过电转化将pBTS-eps转入待改造的芽孢杆菌中，得阳性转化菌株；

(4)挑取(3)中的阳性转化菌落进入液体培养基中进行培养，培养温度为45℃，培养时间大于24h；