[发明专利]一种清洁分解蜡质固定动物组织的方法

说明书

本发明公开了一种清洁分解蜡质固定动物组织的方法，包含对盛装于离心管内石蜡包埋组织切片的处理，操作过程包含以下步骤：加脱蜡液后立即高速离心；在中高温下孵育；从中高温孵育取出后立即高速离心；向离心管内液体中注入蛋白酶K溶液，在中温下孵育；再次高速离心，吸取组织分解液。本发明不用二甲苯，无需煮沸水浴，无需耗时去除蜡质，组织分解能力强，对于多量组织仍然可彻底将其分解并释放核酸，实验操作简单，基本无组织损耗，对核酸破坏少，适用范围广，极少量至大量的石蜡组织切片均可处理。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是一种清洁分解蜡质固定动物组织的方法，特别适用于石蜡固定组织切片中核酸物质的提取和纯化。

背景技术

蜡质包埋组织是保存动物组织细胞核酸物质的常用方法，特别在医院保存人体组织时，一般采用石蜡包埋。当需要对保存组织进行核酸分子检测时，通常切取石蜡组织切片进行核酸的提取和纯化。从石蜡组织中提取核酸物质的关键步骤是将组织从石蜡中分离，将其彻底分解并释放细胞内核酸物质进入溶液中，方可成功提取和纯化核酸。目前石蜡切片组织的分解最常用方法是用二甲苯溶解包埋组织中的石蜡，再用无水乙醇清洗残余的二甲苯。二甲苯和无水乙醇的方法溶解石蜡最彻底，但二甲苯易挥发、气味重、毒性大、对组织破坏力强，并不是一种完美的方法。有人用DMSO作为石蜡溶解剂，DMSO气味小、不易挥发、毒性很低，但DMSO溶解石蜡的能力极为有限，仅能处理1-3张5微米的小薄片，对于较大量的石蜡切片效果很差。2000年上海医学检验杂志上发表的一篇《一种石蜡包埋组织DNA提取方法》论文第一次提出用TES溶液（10mmol Tris-HCL， 1mmol EDTA， 0.5% SDS）脱蜡的方法，查阅Pubmed未发现国外更早的论文描述。该文章中描述的方法是在装有3片5微米厚的石蜡切片组织的1.5ml无菌管中，注入1毫升 TES溶液。65℃水浴10分钟，待冷却后离心，用滤纸吸除上清液和浮蜡，如此吸除3次完成脱蜡。屠其华、张晓萍、袁亚婷、周卫宁等在2006-2013年间发表的科技论文分别描述并试验了TES溶液脱蜡方法。2011年天根生化科技（北京）有限公司提交并于2013年获授权的专利中，描述了在石蜡切片组织中加入特制裂解液，并在高温下煮沸30分钟，离心取清液的方法。该方法不使用二甲苯，也不需要蛋白酶K，专利权描述针对2-4片10微米厚的石蜡包埋组织切片。特制裂解液配方为500微升0.1M NaOH，50微升20%SDS，50微升0.001M二巯苏糖醇。成都晟博源生物工程有限公司于2017年提交的专利中采用NaOH和SDS为溶剂的去蜡液，在100℃水浴30分钟裂解组织，其方法与天根生物工程公司专利所述基本相同。日本Takara的MiniBEST石蜡组织提取试剂盒采用先加入500微升DP液，80℃加热一分钟后再加入180微升GL液，然后离心使蜡质分层的方法。

我们对以上所述的各类方法均进行了试验，发现上述各类方法仍存在较大改进空间。首先，TES溶液法是一种用脱蜡液去除蜡质留下组织的方法。通过该方法处理后离心，蜡质漂浮在液体上层，形成固体层，而脱蜡组织悬浮在液体中部，组织呈展开态，无聚缩，也无法下沉。实际操作时，吸取液体很容易误将组织带出，组织损耗比较大，对多量（如大于5张以上10微米厚）石蜡切片处理时效果更差。蜡质浮于顶层固化，并与离心管内壁四周紧粘，部分蜡质碎屑紧贴固化蜡质下表面，要将蜡质清除是个十分耗时且需要技巧的过程。

天根生化专利方法采用的是一种原位溶解的方法，但其不采用蛋白酶K，对石蜡组织处理量较为有限。当石蜡切片量较多时，即使煮沸半小时仍然无法完全分解组织。而半小时煮沸处理不仅使得实验过程变得复杂，而且有一定危险性。特别在当前实验室消防安全严格要求下，煮沸处理有诸多不便。同时，NaOH碱液的破坏作用和高温煮沸使石蜡组织中本已脆弱易断的核酸更加碎裂，影响了核酸的质量。

针对上述不足，申请人提出了一种清洁分解蜡质包埋组织切片更加简单、方便和有效的方法，该方法不用二甲苯，无需煮沸水浴，无需耗时去除蜡质，组织分解能力强，对于多量组织仍然可彻底将其分解并释放核酸，实验操作简单，基本无组织损耗，对核酸破坏少，适用范围广，极少量至大量的石蜡组织切片均可处理。

发明内容