[发明专利]一种建立大肠癌HK2报告基因细胞系的方法有效
| 申请号： | 201811384392.0 | 申请日： | 2018-11-20 |
| 公开（公告）号： | CN109852586B | 公开（公告）日： | 2019-10-08 |
| 发明（设计）人： | 余红兵;刘欣 | 申请（专利权）人： | 广东医科大学 |
| 主分类号： | C12N5/10 | 分类号： | C12N5/10;C12N15/90;C12Q1/02;C12R1/91 |
| 代理公司： | 深圳智趣知识产权代理事务所(普通合伙) 44486 | 代理人： | 黄秋云 |
| 地址： | 523808 广东省东莞*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 报告基因 大肠癌细胞系 基因位点 大肠癌 整合 质粒 单克隆细胞系 基因表达水平 基因同源重组 绿色荧光蛋白 单细胞筛选 高度一致性 流式细胞仪 电击转化 精准定位 免疫印迹 水平变化 基因 扩增 克隆 筛选 验证 细胞 检测 | ||
1.一种建立大肠癌HK2报告基因细胞系的方法，包括以下步骤：
步骤1：HK2基因下游位点特异性HK2-sgRNA序列设计及评估；其中，HK2-sgRNA序列可选自：
HK2-sgRNA1：TAGAACCCCTGAAATCGGAA(chr2:74890939-74890958)，如SEQ ID NO.1所示；或
HK2-sgRNA2：TGTGTCAGAGACAGACCCCT(chr2:74891015-74891034)，如SEQ ID NO.2所示；
步骤2：构建pX459/HK2-sgRNA质粒；
步骤3：整合HK2基因的同源重组序列和EGFP片段；
步骤4：将上述质粒pX459/HK2-sgRNA和绿色荧光蛋白整合片段按1:1的比例共同电击转化大肠癌细胞系HCT116；
步骤5：通过流式细胞仪单细胞筛选EGFP表达的细胞，并扩增单克隆细胞系；
步骤6：筛选获得的EGFP表达的细胞系进一步通过基因组PCR及免疫印迹方法鉴定HK2报告基因细胞系；
所述步骤2中，构建pX459/HK2-sgRNA质粒的方法如下：根据所述HK2-sgRNA1或所述HK2-sgRNA2的序列，经生物公司合成后直接获得正确的sgRNA序列的质粒pX459/HK2-sgRNA1或pX459/HK2-sgRNA2；步骤3中，整合HK2基因的同源重组序列和EGFP片段的方法如下：根据HK2基因的同源重组序列和EGFP序列，经生物公司合成后直接获得正确的整合片段L-EGFP-R；
所述片段L-EGFP-R的序列如SEQ ID NO.3所示。
2.由权利要求1所述方法制备获得的大肠癌HK2报告基因细胞系在下述(1)-(4)任一中的应用：
(1)在肿瘤细胞发生、发展或能量代谢研究中的应用；
(2)在细胞模型中的应用
(3)在研究HK2基因中的应用；或
(4)在药物筛选中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，所述肿瘤为大肠癌；所述细胞模型为大肠癌细胞模型；所述药物为抗癌药物。
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