[发明专利]猫血清淀粉样蛋白A及其单克隆抗体的制备方法和应用

说明书

本发明属于生物工程技术领域，本发明涉及一种重组蛋白，该重组蛋白包含猫血清淀粉样蛋白A的两个优势抗原表位，为提高该重组蛋白在原核表达系统中的产量，采用大肠杆菌偏爱密码子将该重组蛋白氨基酸序列转换为对应的核苷酸序列，化学合成该核苷酸序列并构建重组表达载体。本发明还涉及该重组蛋白单克隆抗体的制备，经过免疫、细胞融合及多轮筛选后得到杂交瘤细胞株，纯化单克隆抗体并分别标记铕离子(Eu3+)，通过正交实验确定最佳单抗配对组合，可用于猫感染性炎症的早期诊断。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域。具体来说，本发明涉及一种新的重组蛋白，通过基因工程技术编码合成该重组蛋白的核苷酸序列，构建含有上述核苷酸序列的质粒载体，转化有上述质粒载体的大肠杆菌菌株，表达重组猫血清淀粉样蛋白A；使用上述重组蛋白制备猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体，并应用于猫感染性疾病早期炎症的诊断。

背景技术

感染性疾病由细菌、病毒、真菌、寄生虫等病原体引起，是常见病、多发病，严重威胁机体健康，因此寻找利于早期诊疗的感染性标志物具有重要意义。血清淀粉样蛋白A(SAA)是存在于许多物种中的一种主要的急相蛋白，包括人、犬、猫和马。一旦机体受到感染、创伤及外科手术等引起的炎症刺激后，SAA浓度水平会在数小时内迅速升高。由于SAA半衰期非常短，随着炎症源的清除，SAA的浓度水平又会迅速下降。国内外已有研究表明，在细菌、病毒感染、急性炎症、慢性炎症急性发作等急性时相反应性疾病中均可检测到血清SAA升高。与传统感染标志物CRP和WBC 相比，其优势在于病毒感染时也明显升高，且改变高于传统指标。鉴于其以上特性， SAA可作为敏感的感染性疾病标志物用于诊疗，成为继WBC和CRP之后，感染性疾病早期辅助诊断的又一个新指标。因此，在猫感染性疾病炎症诊断中，测定猫血清淀粉样蛋白A(fSAA)可用于诊断亚临床炎症、监控猫炎症和感染的治疗效果。

目前，市场上关于猫感染性疾病早期炎症的诊断主要是对猫血液细胞进行检测分析，如测WBC(白细胞总数)、GR(中性粒细胞数)等，该方法操作繁琐而且成本高，不适合快速诊断，易耽误治疗。

以免疫学为基础的血清学检测，操作简便，结果判定简单，是目前的主流方向。时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)是目前最灵敏的微量分析技术，灵敏度可达 10-12g/mL，其利用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效排除非特异荧光干扰，极大提高了分析灵敏度。通过制备重组猫血清淀粉样蛋白A并免疫小鼠得到相应单克隆抗体，结合时间分辨荧光免疫分析平台筛选最佳单克隆抗体配对，从而实现对猫血清淀粉样蛋白A的快速、高效、特异性检测。

发明内容

设计目的：通过设计一种重组蛋白并制备其单克隆抗体，从而实现猫血清淀粉样蛋白A(fSAA)的特异性识别检测，既增强了检测灵敏度，又不会导致检测结果失真。