[发明专利]一组打破烟草TMV抗性基因N上游（5’端）连锁累赘的分子标记及其应用

权利要求书

1.一组用于确定烟草TMV抗性基因N上游5’端连锁打破程度及位置信息的分子标记，其特征在于，所述分子标记编号为TMn007、TMn025、TMn027、TMn085、TMn113、TMn131、TMn163、TMn183、TMn203、TMn223、TMn226、TMn233、TMn245、TMn249、TMn288、TMn302、TMn306和TMn323_N，其PCR扩增产物核苷酸序列分别为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQID No.10、SEQ ID No.11和SEQ ID No.12、SEQ ID No.13和SEQ ID No.14、SEQ ID No.15和SEQ ID No.16、SEQ ID No.17和SEQ ID No.18、SEQ ID No.19和SEQ ID No.20、SEQ IDNo.21和SEQ ID No.22、SEQ ID No.23、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26所示；所述分子标记所对应的18个位点的引物序列分别为：

TMn007序列为TMn007F：5’- CGACTTCATGAAAGCACCAG -3’，如SEQ ID No.27所示，TMn007R：5’- CTACTGGACTCCACCCACGA -3’，如SEQ ID No.28所示；

TMn025序列为TMn025F：5’- TGGTTAAAACTCCCATCCCTA -3’ ，如SEQ ID No.29所示，TMn025R：5’- TGGAAAATGAATTTTTCGAATG -3’，如SEQ ID No.30所示；

TMn027序列为TMn027F：5’- TTTGTGCCAAAAGAAAAGGAA -3’ ，如SEQ ID No.31所示，TMn027R：5’- TGGAGAGATCGTGAAGGTCA -3’，如SEQ ID No.32所示；

TMn085序列为TMn085F：5’- TGCACGTCTGATACTTTTTGA -3’，如SEQ ID No.33所示，TMn085R：5’- CAACTTTGCACCACCATCAC -3’，如SEQ ID No.34所示；

TMn113序列为TMn113F：5’- CAACACGCACCATCACAAGT -3’ ，如SEQ ID No.35所示，TMn113R：5’- CTATGCTGCCCCTTCTTCAC -3’，如SEQ ID No.36所示；

TMn131序列为TMn131F：5’- TGGTTAAAGCATGCGACTTG -3’，如SEQ ID No.37所示，TMn131R：5’- AGGAGTTTTTCGGCGATTG -3’，如SEQ ID No.38所示；

TMn163序列为TMn163F：5’- TTTACGCCCTCACAAAAACC -3’，如SEQ ID No.39所示，TMn163R：5’- GATTTCACCGTCGGGACTAA -3’，如SEQ ID No.40所示；

TMn183序列为TMn183F：5’- TACCGGTTTTTGGGAAATTG -3’，如SEQ ID No.41所示，TMn183R：5’- GCCCATTTTCTTGGGATTCT -3’，如SEQ ID No.42所示；

TMn203序列为TMn203F：5’- TGAAAGTCACGCAACTCCAA -3’，如SEQ ID No.43所示，TMn203R：5’- CGAAATGTGAAAGGGGAGAA -3’，如SEQ ID No.44所示；

TMn223序列为TMn223F：5’- CTGCTCAGGCCAGTGTGAT -3’，如SEQ ID No.45所示，TMn223R：5’- CACACAGGGTTATAGTCGTCCA -3’，如SEQ ID No.46所示；

TMn226序列为TMn226F：5’- AGATTGCACACGAAATCGTAGA -3’，如SEQ ID No.47所示，TMn226R：5’- GAGAGATAAATGGAAGGAGAACGA -3’，如SEQ ID No.48所示；

TMn233序列为TMn233F：5’- ATTTGGTTGTGTTGCTGTCG -3’，如SEQ ID No.49所示，TMn233R：5’- TGAAAAACAGGGAAGGAGGA -3’，如SEQ ID No.50所示；

TMn245序列为TMn245F：5’- GAGGGCAAATTGGGTAAACA -3’，如SEQ ID No.51所示，TMn245R：5’- GGGTGGTGGGAGACAAATTA -3’，如SEQ ID No.52所示；

TMn249序列为TMn249F：5’- AGTGGGATGAGGTAGGTGGA -3’，如SEQ ID No.53所示，TMn249R：5’- GAATGCTAGATTCCCGGATG -3’，如SEQ ID No.54所示；

TMn288序列为TMn288F：5’- TCATCGTCAATAACGCCATAA -3’，如SEQ ID No.55所示，TMn288R：5’- TGTATGCCGGCTCTAAGGAG -3’，如SEQ ID No.56所示；

TMn302序列为TMn302F：5’- ACGAGCAATTAGGGGTAGGG -3’，如SEQ ID No.57所示，TMn302R：5’- ACCTCTTCTATCGCCATGCT -3’，如SEQ ID No.58所示；

TMn306序列为TMn306F：5’- TTGCTCAAATCCTTTGTGTCC -3’，如SEQ ID No.59所示，TMn306R：5’- TCATCCACTCTTGTGGCTTTT -3’，如SEQ ID N .60所示；

TMn323_N序列为TMn323_NF：5’- GCAGTTCAAATGGGAACACA -3’，如SEQ ID No.61所示，TMn323_NR：5’- TGAAACCGAAATCGTCAAAG -3’，如SEQ ID No.62所示。

2.一种根据权利要求1中所述分子标记的应用，其特征在于，利用所述分子标记来检测和判断待测烟草中N基因上游5’端的连锁累赘是否被打破及连锁累赘打破的精确位置信息；首先，以TMn323_N序列的引物对待测烟草基因组DNA进行PCR扩增，检测PCR扩增产物中是否含有如SEQ ID No.26所示序列来判断该待测烟草是否含有N基因而具有TMV抗性，即，PCR扩增产物中含有如SEQ ID No.26所示序列，则表明该待测烟草基因组中含有TMV抗性基因N，反之，则表明该待测烟草基因组中无N基因存在；其次，在已知含有N基因的前提下，利用除TMn323_N外的17组引物分别扩增待检测烟草基因组DNA，检测PCR扩增产物，如果PCR扩增产物中含有如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.13、SEQ ID No.15、SEQID No.17、SEQ ID No.19、SEQ ID No.21、SEQ ID No.23、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25所示的全部17个序列即为在N基因上游5’端存在完全连锁累赘；如若上述17个PCR扩增产物序列均不存在，则为在N基因上游5’端的连锁累赘完全被打破；如若上述17个PCR扩增产物序列仅有部分存在，则表示在N基因上游5’端的连锁累赘部分被打破，即，有PCR扩增产物序列存在的位置处，连锁累赘未被打破，没有PCR扩增产物序列的位置处，连锁累赘完全被打破；此外，如若PCR扩增产物中仅含有如SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.12、SEQ IDNo.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.18、SEQ ID No.20、SEQ ID No.22所示的8条序列，则同样表明在N基因上游5’端存在上述PCR扩增产物序列位置处的连锁累赘完全被打破；如若PCR扩增产物中含有SEQ ID No.2和SEQ ID No.3、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5、SEQ ID No.11和SEQ ID No.12、SEQ ID No.13和SEQ ID No.14、SEQ ID No.15和SEQ ID No.16、SEQ IDNo.17和SEQ ID No.18、SEQ ID No.19和SEQ ID No.20、SEQ ID No.21和SEQ ID No.22所示的两两序列组合形式中任何一个组合存在，则表明在N基因上游5’端存在部分的连锁累赘，即，上述有两个PCR扩增产物序列以组合形式存在的位置处，连锁累赘部分被打破，具体的信息见表1：

表1 公开的18对引物PCR扩增产物核苷酸序列信息及其在烟草N基因上游5’端打破连锁累赘的位置信息