[发明专利]一种基于sanger测序快速鉴定人体真菌的方法

说明书

本发明公开了一种基于sanger测序快速鉴定人体真菌的方法，其特征在于，包括DNA提取和质检步骤、引物设计和合成步骤、PCR扩增步骤、PCR产物纯化步骤、PCR产物纯化步骤、测序步骤、数据处理步骤。本发明的有益效果在于：可以通过特异的引物把具体的物种的基因序列扩增出来，并通过测序验证比对，一一对应，准确率几乎接近百分之百。而且只需要提取一定的菌落提取DNA后保存，避免了在培养过程中产生交叉污染，导致误判。本方法相比其他方法，方便、快捷、准确性高。

技术领域

本发明属于高通量测序技术领域，具体涉及一种基于sanger测序快速鉴定人体真菌的方法。

背景技术

现如今常用的几种真菌检测方法有：

1.直接显微镜检测取分泌物等被检材料涂于载玻片上，在镜下观察菌丝形态结构来判断到底是什么菌。

2.分离培养标本接种于特定的培养基中，室温培养后菌落成型，通过外观判断是什么菌，同时将菌落涂片镜检。

3.药物敏感试验

由于现在很多菌的菌落形态很相似，易造成混淆，且随着物种的进化，很多菌都具有耐药性，所以常规的方法鉴定出来的菌种不一定正确可靠，具有缺陷。

双脱氧链终止法(Sanger法)测序由Frederick Sanger于1977年发明，主要可用于DNA序列分析，核酸模板在核酸聚合酶、引物、四种单脱氧碱基存在的条件下复制或转录时，分4管引入带不同荧光4种双脱氧碱基，DNA 聚合酶可以将4种不同双脱氧核苷三磷酸原料插入DNA链中，由于双脱氧核苷三磷酸的3’位缺少-OH基团，将不会继续延伸，这样可以得到带不同荧光的不同长度DNA片段。

也有人开始将这种方法用于鉴定真菌的种属，而基于此方法的进一步深入研究和发展也变得非常重要。

而Sanger测序的优势在于：

(1)精准：流程细致，质控环节多，污染低，结果直观可视，假性结果极低。

(2)可进行个性化位点检测，可以任意选择单项测序，Sanger测序个性化基因检测有价格优势。由于临床测序特点是：“目标明确、结果精准、通量小”，Sanger测序非常适用于临床。

发明内容

为了克服现有技术所存在的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种基于 sanger测序快速鉴定人体真菌的方法。

为了实现本发明的目的，所采用的技术方案是：一种基于sanger测序快速鉴定人体真菌的方法，包括如下步骤：

DNA提取和质检步骤：使用分泌物(真菌)DNA提取试剂盒进行DNA提取；使用NanoDrop2000检测样品浓度和纯度，当样品的浓度>10ng/uL和纯度在 1.6～2.0之间，视为合格；

引物设计和合成步骤：根据要扩增的目的基因序列，在在NCBI网站 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi？LINK_LO C＝BlastHome)上进行设计，设置的主要参数为：引物长度一般为18～24bp；理论退火温度Tm值55℃～65℃；(G+C)含量40％～70％；扩增片段大小<800bp。将设计出来的引物信息做好记录，包括引物名称，序列以及产物的大小；然后进行引物的合成；

PCR扩增步骤：确认DNA模板质量合格的情况下，可以安排进行PCR扩增，反应体系为25ul；以基因组为模板选用New England Biolabs,Ltd Q5超保真DNA聚合酶进行PCR扩增；

PCR产物纯化步骤：使用1.5％琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增后的未纯化样品进行纯化；

测序步骤：使用ABI公司的BDT3.1测序试剂盒进行测序的前处理后放入测序仪进行测序；