[发明专利]猫疱疹I型病毒快速检测的制备方法

说明书

本发明属于生物工程技术领域，通过对猫疱疹I型病毒抗原序列进行分析，选择其中一段优势抗原表位序列，为增加其在原核细胞中的表达效果，将该序列进行重复，并采用大肠杆菌最嗜密码子合成对应的核苷酸序列。采用基因工程方法将上述核苷酸序列插入原核表达载体并构建重组表达菌株，该表达菌株通过IPTG诱导后产生重组蛋白FHV51，最终基于该重组蛋白建立猫疱疹I型病毒胶体金诊断方法。本发明主要涉及猫疱疹I型病毒重组抗原的制备、该重组抗原多抗的制备及基于该重组蛋白建立的一种猫疱疹I型病毒急性感染与潜伏期感染的快速诊断方法。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，通过对猫疱疹I型病毒抗原序列进行分析，选择其中一段优势抗原表位序列，为增加其在原核细胞中的表达效果，将该优势抗原表位序列进行重复，并采用大肠杆菌最嗜密码子合成对应的核苷酸序列。采用基因工程方法将上述核苷酸序列插入原核表达载体并构建重组表达菌株，该表达菌株通过IPTG 诱导后产生重组蛋白FHV51，最终基于该重组蛋白建立猫疱疹I型病毒胶体金诊断方法。本发明主要涉及猫疱疹I型病毒重组抗原的制备、该重组抗原多抗的制备及基于该重组蛋白所建立的一种猫疱疹I型病毒急性感染与潜伏期感染的快速诊断方法。

背景技术

猫疱疹病毒1型(feline herpesvirus-1，FHV-1)属于疱疹病毒科，α－疱疹病毒亚科成员，主要引起猫科动物的传染性鼻气管炎，是猫的一种急性上部呼吸道感染性非常强的急性传染病。FHV-1主要感染幼猫，感染后在上呼吸道黏膜复制导致猫出现体温升高、精神沉郁、咳嗽、打喷嚏等临床症状与慢性鼻窦炎、角膜结膜炎等并发症，发病率为100％，幼猫病死率可达50％。且感染猫康复后，FHV-1潜伏于三叉神经、视神经、扁桃体、颌下淋巴结、鼻甲骨以及口鼻眼分泌物内，造成持续性感染和潜伏性感染，还可再活化引起感染猫的二次发病，因此对猫疱疹I型病毒的早期诊断以及潜伏性感染的诊断与治疗尤为重要。

目前，常用的FHV-1诊断方法包括病毒的分离鉴定、血清学诊断及分子生物学诊断技术。

1、病毒的分离鉴定

因FHV-1型病毒在细胞内能迅速复制并产生典型的细胞病变，故通过采集眼、咽拭子(急性感染)或结膜、角膜刮取物(慢性感染)，将样本处理后接种猫肾细胞 (FK-81)，接种2d后出现典型的细胞病变，表现为细胞灶状圆缩、形成合胞体、出现多核巨细胞。病毒分离虽能准确诊断出FHV-1感染，但FHV-1对外界环境抵抗力较弱，且只能在FK-81细胞上增殖，运输过程中极易造成病毒的失活，且检测费时，临床上一般不建议使用病毒的分离进行诊断。

2、血清学诊断

主要包括免疫荧光试验(FA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、中和试验以及血凝-血凝抑制试验(HA-HI)。

免疫荧光试验：取患病猫角膜、结膜刮取物以及活体组织切片处理后，与荧光素标记的抗体相结合，通过荧光显微镜下观察特异性荧光进行诊断。该方法敏感度低，仅能诊断急性感染期的患病猫，对于自发慢性感染的猫群检测成功率较低。

酶联免疫吸附试验(ELISA)：利用可溶性抗原与抗体特异性结合的原理，通过酶标显色进行抗原或抗体的检测。ELISA方法可检测FHV-1血清抗体，但检测耗时，操作繁琐，限制了其大规模生产与投放。

中和试验：由于FHV-1原发感染时机体的抗体滴度较低，复发感染后血清抗体滴度大幅升高，可用于FHV-1抗体效价及区分FHV-1原发与继发感染的检测。但抗体效价的检测与患病猫临床表现无关，一般不采用该法进行诊断。

血凝-血凝抑制试验(HA-HI)：利用FHV-1可以凝集猫红细胞的特点实现FHV-1 感染的检测，但目前对于FHV-1血凝性仍存在争议，未建立系统的HA-HI诊断方法。

3、分子生物学诊断