[发明专利]基于杂交兰转录组开发的EST-SSR标记引物及应用

说明书

本发明公开了杂交兰EST‑SSR引物，及其在杂交兰植物的种质资源遗传多样性分析、遗传图谱构建和标记辅助育种中的应用。本发明公开了9组引物对，以及杂交兰EST‑SSR引物的筛选方法，具体包括：获取目标杂交兰叶片的原始基因数据库、对原始基因数据库进行SSR位点搜索、Primer 5.0对目标序列进行PCR引物设计，并生成候选引物；对候选引物进行PCR扩增，选出初筛分PCR引物，最后筛选出杂交兰EST‑SSR引物。本发明提供的9对EST‑SSR标记引物来自于杂交兰叶片转录组序列，引物的多态性丰富、扩增稳定、扩增条带易于鉴定，是稳定存在的新标记，填补了杂交兰基于转录组开发SSR引物的空白。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及基于杂交兰转录组开发的EST-SSR标记引物及应用。

背景技术

杂交兰(Cymbidium hybrid)是由国兰和大花蕙兰杂交培育而成的一类兰花的特称，不仅有国兰的植株小巧、幽香，还具有大花蕙兰的花大、色艳等优异特性，拥有较高的观赏、经济和文化价值，近年来深受消费者的喜爱，已成为兰花市场中新兴的、具发展潜力的兰花新种类，市场前景广阔。目前，有关杂交兰的研究主要集中在组织培养技术、栽培技术、花期调控等方面，对于杂交兰遗传多样性、遗传图谱构建、基因定位等方面的研究还很少。杂交兰中用于以上研究的分子标记仅为一些通用引物如RAPD，SRAP等，这大大限制了杂交兰分子育种的进程。

表达序列标签微卫星(EST-SSR)是一种基于表达序列标签的简单序列重复设计的新型分子标记，具多态性高、共显性遗传、重复性好、开发成本低等优点，且其来自基因组的编码区，与功能基因紧密连锁，更容易获得基因表达的信息。随着EST数据库不断丰富和高通量测序技术发展，EST-SSR在植物上被大量开发和应用，但有关EST-SSR在杂交兰中的应用研究还未见报道。

因此，建立一种基于杂交兰叶片转录组筛选EST-SSR引物方法，筛选出杂交兰EST-SSR引物，对杂交兰植物的种质资源遗传多样性进行分析、遗传图谱构建和标记辅助育种是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了杂交兰EST-SSR引物以及杂交兰EST-SSR引物在杂交兰植物的种质资源遗传多样性分析、遗传图谱构建和标记辅助育种中的应用。其中本发明的9对EST-SSR标记引物来自于杂交兰叶片转录组序列，引物的多态性丰富、扩增稳定、扩增条带易于鉴定，是稳定存在的新标记，填补了杂交兰基于转录组开发SSR引物的空白。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

杂交兰EST-SSR引物，包括以下9组引物对，其核苷酸序列如下：

F1：5'-TGGCACTAGTCAACCGTCAG-3'；SEQ ID NO.1；

R1：5'-GCCAGTTACTTTCCTTAGGCG-3'；SEQ ID NO.2；

F2：5'-CCGAGCACTGAAACATGAGA-3'；SEQ ID NO.3；

R2：5'-CACATGTGCTTGCTACCGAC-3'；SEQ ID NO.4；

F3：5'-GGAAACTAGTGAACCAGACGG-3'；SEQ ID NO.5；

R3：5'-CGCGATGCCATTTCTTATTC-3'；SEQ ID NO.6；

F4：5'-CCCAGTGTTCTCCTGGTCAT-3'；SEQ ID NO.7；

R4：5'-ATTCTCCGTACCGTCTGGTG-3'；SEQ ID NO.8；

F5：5'-AGGCACATAGGAGAGCCTGA-3'；SEQ ID NO.9；