[发明专利]一种可以产2’-岩藻基乳糖菌株的构建方法

说明书

本发明涉及大肠杆菌菌株技术领域，具体是指一种可以产2’‑岩藻基乳糖菌株的构建方法，包括以下步骤：(1)提供一种2’‑岩藻基乳糖产量高，可以大幅度提高2’‑岩藻基乳糖的含量的大肠杆菌菌株E.coli K‑12 ZK‑2；(2)构建大肠杆菌菌株E.coli K‑12 ZK‑2，采用CRISPR/CAS9系统对大肠杆菌基因进行敲除，得到敲除菌株；(3)将与2’‑岩藻基乳糖代谢途径相关的基因构建到表达质粒中，导入敲除株内进行2’‑岩藻基乳糖相关基因的表达；(4)发酵后，通过提取、超滤、浓缩和分离等获得2’‑岩藻基乳糖。本发明与现有技术相比的优点在于：为将来用于婴幼儿配方奶粉中提供了可能，并且可以大幅度降低生产成本。

技术领域

本发明涉及大肠杆菌菌株技术领域，具体是指一种可以产2’-岩藻基乳糖菌株的构建方法。

背景技术

母乳为婴儿营养的重要的来源，婴儿的营养品中，奶粉作为第三大最丰富的固体营养物质，其中所含 有的人乳低聚糖(HMO)对婴儿的健康起关键作用，岩藻糖基化的HMO，包括2‘-岩藻糖乳糖(2’-FL)， 3-岩藻糖(3-FL)，乳糖新N-四糖(LNnT)等，这些物质可选择性地刺激双歧杆菌的生长，这些岩藻糖基化 的人乳低聚糖能够形成致病菌受体的类似物，从而保护婴儿抵抗肠道病原体的感染，如肠道致病性大肠杆 菌、霍乱弧菌和沙门氏菌，此外，岩藻糖基化的HMO类似于Lewis抗原糖链结构在炎症和肿瘤转移中起 着关键作用，能够识别肿瘤细胞的结构并将其转移，在岩藻糖化HMOs，2’-岩藻基乳糖能够抑制细菌或 病毒粘附在上皮细胞上，这些功能性糖由于它们在营养保健方面的潜在应用而引起了制药业极大的关注。

目前2’-岩藻基乳糖可以通过母乳分离或化学合成的方法获得，然而，有限的母乳来源以及化学合成 过程中对侧链的保护和脱保护的严格要求限制了其生产，并且增加了成本，最近的研究表明，发现和鉴定 了几种岩藻糖基转移酶，如来源于幽门螺杆菌、双孢杆菌，拟杆菌ATCC 8482，空肠弯曲杆菌和大肠杆菌 O 128，O86，O 126和O 127等等，因此，2’-岩藻基乳糖可以利用α1，2-岩藻糖基转移酶酶法合成，然 而，这个反应需要充分的底物GDP-L岩藻糖，增加了大规模合成的成本。

代谢工程和合成生物学的发展为利用微生物合成2’-岩藻基乳糖提供了可能性，在大肠杆菌和沙门氏 菌中，GDP-L-岩藻糖参与了细胞壁主要成分荚膜异多糖酸的生物合成，因此，2’-岩藻基乳糖可以由加强 GDP-L-岩藻糖生物合成途径的研究将外源岩藻糖基转移酶基因导入大肠杆菌，用于2’-岩藻基乳糖的合成， 基于对来源于幽门螺杆菌的α1，2-岩藻糖基转移酶(FutC)的鉴定及功能研究，它能够以乳糖作为为受体的 底物进行异源表达，从而促进了2’-岩藻基乳糖利用生物技术合成的研究。

发明内容

以解决上述背景技术中提出的问题，本发明的目的在于提供一种可以产2’-岩藻基乳糖菌株的构建方 法，为将来用于婴幼儿配方奶粉中提供了可能，并且可以大幅度降低生产成本。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：一种可以产2’-岩藻基乳糖菌株的构建方法，包括 以下步骤：(1)提供一种2’-岩藻基乳糖产量高，可以大幅度提高2’-岩藻基乳糖的含量的大肠杆菌菌 株E.coliK-12ZK-2；

(2)构建大肠杆菌菌株E.coliK-12ZK-2，采用CRISPR/CAS9系统对大肠杆菌基因进行敲除，得到 敲除菌株；

(3)将与2’-岩藻基乳糖代谢途径相关的基因构建到表达质粒中，导入敲除株内进行2’-岩藻基乳 糖相关基因的表达；

(4)发酵后，通过提取、超滤、浓缩和分离等获得2’-岩藻基乳糖。

作为改进，所述的步骤(2)具体包括以下步骤：a、菌株改造：采用crispr/cas9编辑技术将大肠杆菌 基因进行敲除，其相关基因包括lacZ，lacA，melA，wcaJ，mdoH，nanKETA；