[发明专利]一种全长转录本水平高通量检测单细胞中基因突变的方法

说明书

本发明公开了一种全长转录本水平高通量检测单细胞中基因突变的方法，涉及核酸检测领域，包括使用单细胞分析仪标记单细胞并对单细胞中的各种mRNA进行标记，使用待检基因的特异引物扩增富集单细胞中该基因的全长cDNA序列，对扩增获得的片段进行三代测序文库的构建以及使用PacBio测序仪对待检基因的全长cDNA文库进行测序，获得单细胞水平的待检基因的序列信息。

技术领域

本发明涉及核酸检测领域，尤其涉及一种全长转录本水平高通量检测单细胞中基因突变的方法。

背景技术

基因转录本的突变检测是指用实验方法鉴定个体所表达的RNA的基因序列所产生突变位点的技术。

对突变的检测可以在基因组水平上进行，也可以在转录组水平上进行。如果用基因组为样本对个体的序列突变进行检测鉴定，可以通过DNA抽提，对靶序列使用特异引物扩增再进行一代测序鉴定突变。也可以用抽提得到的DNA进行二代测序文库构建，对文库进行测序后，分析所得的测序数据获得个体基因突变的信息。前一种技术的通量低，但是比较经济，速度快，至今还是鉴定序列突变的常用手段。第二种方法的优点是数据量大，通量高，通过一次测序可以获得大部分基因组中的序列突变信息，但是缺点是周期长，分析复杂度高，花费高。而且可能有许多信息并不需要。由第二种方案衍生出的捕获测序很好的解决了部分问题，测定区域相对重测序小了很多，所需要测定的数据量根据靶标的大小调整，不需要测大量的数据。但是因为还是采用二代测序的方案，因此对有些长片段中带有部分重复序列的测序则在后期分析时会遇到障碍。

另外，对个体的RNA尤其是mRNA进行测序也是找到表达基因突变位点的一种手段，如果研究者关注的是某个基因或某几个基因的突变，可以通过扩增目标基因的cDNA序列，再进行序列测定，从而获得相关信息。如果是对未知的mRNA序列突变感兴趣，那么就以个体的mRNA为模板建库进行二代测序，通过对测序数据进行分析获得序列的突变信息。

虽然以上的实验方案都能够使研究者达到研究目的，但是这两种方法都是建立在大宗组织基础上的一种鉴定手段，有些研究需要确认某个基因的特定序列突变发生在某个细胞中，这就需要对每个细胞中的序列信息进行鉴定，以获得单个细胞中的序列信息。例如肿瘤样本中的细胞存在极高的异质性，一个肿瘤样本的多个细胞可能存在一个基因的多种突变形式，而不同的突变形式可能又会影响个体的疾病状态。这时如果能够找出每个细胞中的序列变异的情况就能够为疾病的诊断和治疗提供更精准的信息。另外，基因编辑手段现在已经在科学研究中被广泛应用，但是一旦对基因进行编辑之后，对被编辑细胞的基因序列突变位点的确认也是必须的。而近几年出现的单细胞测序技术为这种问题的解决提供了途径，尤其是近两年出现的一些单细胞仪器使研究人员对单细胞表达谱的研究成为了现实。但是因为目前的单细胞分析仪大多是采用二代测序方法进行序列测定，其测序长度受到限制，有些长片段序列测序后无法拼接，导致转录本的突变信息得不到，因此在鉴定全长转录本突变方面受到一定的限制，有些研究工作无法完成。

为解决单细胞转录本突变的测序确认，针对上述缺陷，我们把单细胞分析方法和长片段测序相结合，根据靶基因的检测目标序列设计引物并扩增目标序列再对序列进行三代长片段测序，旨在高通量解决全长转录本的单细胞中的基因突变问题。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是在全长转录本水平上高通量检测单细胞中基因突变。

为实现上述目的，本发明提供了一种全长转录本水平高通量检测单细胞中基因突变的方法。本发明包括以下步骤：

一种全长转录本水平高通量检测单细胞中基因突变的方法，包括使用单细胞分析仪对单个细胞进行标记，使用待测基因的特异引物对该基因的全长cDNA序列进行扩增富集，使用长片段建库方案对扩增获得的cDNA进行测序文库构建，使用长片段测序仪对cDNA全长进行测序。