[发明专利]一种赖氨酸氮连接磷酸化翻译后修饰富集和鉴定的方法

权利要求书

1.一种赖氨酸氮连接的磷酸化翻译后修饰肽段的富集和鉴定方法，其特征在于：

步骤（ 1）对蛋白酶解产物中的赖氨酸进行化学标记；

步骤（ 2）对于步骤（1）中化学标记的蛋白酶解产物进行去除赖氨酸上磷酸基团的操作；

步骤（ 3）对步骤（2）中除去磷酸基团的蛋白酶解产物进行可断裂的疏水化衍生；

步骤（ 4）对步骤（3）中疏水化衍生的肽段进行特异性富集；

步骤（ 5）对步骤（4）中富集到的肽段进行去疏水链断裂，最后对其进行质谱鉴定；

可断裂的疏水化衍生的过程采用的可断裂疏水化衍生化试剂是：能与肽段赖氨酸侧链的α氨基发生高选择性反应同时生成可断裂疏水性化学标签的分子。

2.按照权利要求1所述的富集和鉴定方法，其特征在于：蛋白酶解产物是胰蛋白酶、丝氨酸蛋白酶以及蛋白内切酶中的一种或二种以上对蛋白进行酶解后的产物。

3.按照权利要求1所述的富集和鉴定方法，其特征在于：化学标记的过程为，化学标记采用是能与肽段N端和赖氨酸侧链的α氨基发生选择性反应同时生成化学标签的试剂中的一种或二种以上，该试剂包括酸酐类试剂：重量比0.01-100%的乙酸酐、丙酸酐、丁二酸酐中的一种或二种以上；羧基活化类试剂：重量比0.01-100%的N-羟基丁二酰亚胺、4-二甲氨基吡啶中的一种或二种以上；醛类试剂：重量比0.01-100%的甲醛、乙醛、丙醛中的一种或二种以上；以及氨基酸类试剂：0.01-1 M的精氨酸、赖氨酸、组氨酸中的一种或二种以上；

反应的缓冲体系为：pH 7-9，浓度为10-500 mM的磷酸缓冲液、pH 7-9，浓度为10-500mM的碳酸氢铵缓冲液、pH 6-10，浓度为10-500 mM的Tris-HCl缓冲液中的一种或二种以上。

4.按照权利要求1所述的富集和鉴定方法，其特征在于：除去磷酸基团的蛋白酶解产物的过程为，运用磷酸酶去除法和酸去除法中的一种或两种；

所述磷酸酶去除法是采用一种或两种赖氨酸磷酸酶去除赖氨酸上的磷酸基团的方法，磷酸酶包括碱性赖氨酸磷酸酶或酸性赖氨酸磷酸酶中的一种或两种；

所述酸去除法是采用酸性物质去除赖氨酸上的磷酸基团的方法，酸性物质是pH大于或等于1.0，小于或等于4.0的液体物质，具体为质量比为0.1%-100%的盐酸、硫酸、硝酸、甲酸、乙酸、丙酸、三氟乙酸、三氯乙酸中的一种或二种以上。

5.按照权利要求1所述的富集和鉴定方法，其特征在于：可断裂是指能够在光照、酸性或化学条件下发生化学键断裂的基团；

光照条件可断裂基团包括硝基苯在100-1000 nm波长范围内的照射下断裂；

酸性条件可断裂基团包括：席夫碱在pH 1-6的磷酸、盐酸、硫酸、硝酸、甲酸、乙酸、三氟乙酸中的一种或二种以上水溶液中断裂；

化学条件可断裂基团包括：邻二羟基在高碘酸钠水溶液中断裂和/或二硫键在二硫苏糖醇或三(2-羧乙基)膦水溶液中断裂。

6.按照权利要求1所述的富集和鉴定方法，其特征在于：

疏水化衍生是指通过化学反应使得肽段的疏水性增加;

疏水性化学标签包括：长度为1-100个碳的脂肪族碳链、具有1-100个芳香环的芳香族化合物、以及由1-100个碳的脂肪碳链与1-100个芳香环组成的化合物中的一种或二种以上。

7.按照权利要求1所述的富集和鉴定方法，其特征在于：能与肽段赖氨酸侧链的α氨基发生选择性反应的基团包括下述中的一种或二种以上,

琥珀酰亚胺酯基团：重量比0.01-100%的琥珀酰亚胺酯；酸酐基团：重量比0.01-100%的乙酸酐、丙酸酐、丁二酸酐中的一种或二种以上；羧基活化基团：重量比0.01-100%的N-羟基丁二酰亚胺、4-二甲氨基吡啶中的一种或二种以上；醛基团：重量比0.01-100%的甲醛、乙醛、丙醛中的一种或二种以上；以及氨基酸基团：0.01-1M的精氨酸、赖氨酸、组氨酸中的一种或二种以上。