[发明专利]芳香烃受体核转位蛋白ARNT——一种新型海洋生物污染检测标志物

权利要求书

1.芳香烃受体核转位蛋白ARNT，其特征在于：其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

2.一种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求1所述的芳香烃受体核转位蛋白。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

4.权利要求1-3任一项所述的芳香烃受体核转位蛋白ARNT的克隆方法，包括：准备样品、提取总RNA、合成cDNA第一链、克隆核心序列、PCR产物的克隆及序列分析、生物信息学分析，其特征在于：所述芳香烃受体核转位蛋白ARNT克隆核心序列中PCR扩增的简并引物为：

ARNT 01F：5′-TGTACCGGGCCCATCAAAGCTTGGCC-3′和

ARNT 02R：5′-CACGTCTGACTAAGGAGGCTGAAA-3′。

5.根据权利要求4所述的芳香烃受体核转位蛋白ARNT的克隆方法，其特征在于包括以下步骤：

准备样品：取健康均匀的厚壳贻贝在温度20～25℃，pH值8.0条件下饲养；

提取总RNA：以厚壳贻贝作为材料，提取各组织总RNA；

合成cDNA第一链：以获得的总RNA样品作为模板，oligo(dT)₂₀为反转录引物反转录合成，获得cDNA第一链；

克隆核心序列：使用简并引物ARNT 01F和ARNT 02R，以上述cDNA为模板，用Taq DNA聚合酶(TaKaRa)PCR扩增出核心序列；

克隆全长序列：分别设计引物扩增3′RACE和5′RACE未知片段，将3′端、5′端和核心片段序列进行拼接；

PCR产物的克隆及序列分析：PCR产物经电泳纯化、回收后克隆至pMD18-T载体，转化感受态E.coil DH5α，利用M13正反向引物，通过PCR反应得到阳性克隆，送检测序并分析；

生物信息学分析：芳香烃受体核转位蛋白ARNT cDNA片段大小为2043bp，共编码681个氨基酸。

6.根据权利要求5所述的芳香烃受体核转位蛋白ARNT的克隆方法，其特征在于：所述克隆核心序列中的PCR反应体系总体积25.0μl，其中ddH₂O 15.5μl、10×PCR buffer 2.5μl、20mM MgCl₂ 2.5μl、2.5mM dNTP 1.0μl、10μM引物各1.0μl、cDNA 1.0μl、rTaq酶0.5μl。

7.根据权利要求5或6所述的芳香烃受体核转位蛋白ARNT的克隆方法，其特征在于：所述克隆核心序列中的PCR反应的程序为：94℃预变性3min，94℃1min，40℃1min，72℃1min，共30个循环，最后72℃延伸5min。

8.一种利用权利要求1-7任一项所述的芳香烃受体核转位蛋白ARNT用作新型海洋生物污染检测标记物，其特征在于：以厚壳贻贝作为检测海洋污染的生物样本，以厚壳贻贝芳香烃受体核转位蛋白ARNT用作海洋污染的检测标记物。

9.如权利要求1-7任一项所述的芳香烃受体核转位蛋白ARNT用作新型海洋生物污染检测标记物在海洋污染检测中的应用。

10.一种利用权利要求8或9所述的新型海洋生物污染检测标记物检测海洋生物污染的方法，其特征在于包括：通过对受到污染区域厚壳贻贝的解剖提取消化腺和腮中的RNA，反转录成DNA，再利用荧光定量技术检测芳香烃受体核转位蛋白ARNT在消化腺和腮中的相对表达量，即可。