[发明专利]一种基于秀丽线虫检测塑化剂多世代蓄积毒性的方法

权利要求书

1.一种基于秀丽线虫检测塑化剂多世代蓄积毒性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，培养秀丽线虫至产卵期，用磷酸钾缓冲液清洗并收集产卵期秀丽线虫，再用裂解液裂解秀丽线虫母体并收集对裂解液有抵抗能力的虫卵，用磷酸钾缓冲液清洗，加入磷酸钾缓冲液调整秀丽线虫虫卵浓度为10枚/μL，得处于同一时期的虫卵溶液；

S2，将S1中的虫卵溶液培养12-18h，使虫卵孵化但保持在L1幼虫时期，将L1幼虫培养至L4幼虫时期，用磷酸钾缓冲液清洗并调整L4幼虫浓度为19-21条/100μL，得幼虫溶液；用磷酸钾缓冲液清洗并调整大肠杆菌OP50溶液在波长570nm时吸光度1.2-1.4，得菌液；

S3，设置不同的待检塑化剂样品浓度梯度，每个浓度塑化剂样品中依次加入S2中的幼虫溶液和菌液，20℃下染毒培养48h，4h/次记录虫体死亡数，计算塑化剂样品的LC50；

其中，塑化剂样品：幼虫溶液：菌液的体积用量比为2:1:1；

S4，配制LC50的1/1000浓度的塑化剂样品，加入S1中的虫卵溶液、S2中的菌液，20℃下染毒培养48h，记为P0代，然后分别测定P0代寿命、体长、身体弯曲和头部摆动频率指标；

其中，塑化剂样品：虫卵溶液：菌液的体积用量比为2:1:1；

S5，用磷酸钾缓冲液将S4中P0代清洗并收集，重复S1、S4并分别获得F1代、F2代、F3代的寿命、体长、身体弯曲和头部摆动频率指标；

S6，如果F1代与P0代各指标差异中任一项有统计学意义，则塑化剂样品有明确的世代蓄积毒性；如果F1代与P0代各指标差异均无统计学意义，且F2代与P0代各指标差异中任一项有统计学意义，则塑化剂样品有中等的世代蓄积毒性；

如果F1代与P0代、F2代与P0代各指标差异均无统计学意义，且F3代与P0代各指标差异中任一项有统计学意义，则塑化剂样品有轻度的世代蓄积毒性；如果F1代与P0代、F2代与P0代、F3代与P0代各指标差异均无统计学意义，则塑化剂样品无明确世代蓄积毒性。

2.如权利要求1所述的基于秀丽线虫检测塑化剂多世代蓄积毒性的方法，其特征在于，塑化剂样品为邻苯二甲酸酯类塑化剂。

3.如权利要求1所述的基于秀丽线虫检测塑化剂多世代蓄积毒性的方法，其特征在于，S1、S2中秀丽线虫的培养条件均为：20℃下在NGM培养基中培养。

4.如权利要求1所述的基于秀丽线虫检测塑化剂多世代蓄积毒性的方法，其特征在于，磷酸钾缓冲液中含53mmol/L的NaCl和32mmol/L的KCl。

5.如权利要求1所述的基于秀丽线虫检测塑化剂多世代蓄积毒性的方法，其特征在于，S1中裂解液的组成：0.45mol/L的NaOH和质量浓度为2％NaClO。

6.如权利要求1所述的基于秀丽线虫检测塑化剂多世代蓄积毒性的方法，其特征在于，配制塑化剂样品溶液时以体积浓度为1％的二甲亚砜溶液为溶剂。

7.如权利要求1所述的基于秀丽线虫检测塑化剂多世代蓄积毒性的方法，其特征在于，塑化剂样品溶液的浓度≤20mg/mL。