[发明专利]一种无血清干细胞冻存液及干细胞冻存方法

说明书

本发明提供了一种无血清干细胞冻存液及干细胞冻存方法，包括DMSO、无血清培养基及其他成分，以体积百分含量计，其中DMSO占8‑12％，无血清培养基为占总体积的83‑87％，其他成分占3‑8％。本发明所述的冻存液可在较长冷冻时间内保持干细胞活力和特性，并对不同种类和不同种属来源干细胞均具有良好冻存保护效果。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，尤其是涉及一种无血清干细胞冻存液及干细胞冻存方法。

背景技术

干细胞治疗是器官功能衰竭、肿瘤及遗传性疾病等复杂疾病的一种新型治疗方法，干细胞也是疾病机制和药理研究的热点之一。干细胞在细胞治疗和再生医学上具有广阔的应用前景，因此在科研及临床的应用也越来越广泛。但是，目前临床使用的干细胞大多是经体外培养、低温保存后的，研究表明，早期代数的干细胞生物学效果要明显由于传代较多的晚期干细胞。此外，也有人认为由于干细胞高增殖活性，长时间培养后会容易导致基因型改变、染色体畸变和表型不稳定等问题。因此，干细胞的早期冻存是维持其使用时细胞状态稳定性和有效性的必要条件，找到对干细胞存活和功能影响最小的冻存方法，也是干细胞应用于临床治疗的挑战之一。

干细胞冻存液是目前干细胞冻存必须使用的一种复合缓冲液，其主要作用包括：1)保持干细胞特性稳定；2)保护干细胞在低温冷冻过程中受到破坏和伤害；3)保持干细胞冻存复苏后仍具有较高的活力、增殖性和功能。

该干细胞冻存液中的一个关键成分是冷冻保护剂。二甲基亚砜(DMSO)是一种被广泛使用的渗透性冷冻保护剂，其主要作用是防止冻存过程中细胞内冰晶形成、避免高浓度冻存剂的毒性和使细胞在耐受度内脱水。不过有研究发现如果DMSO使用浓度过低，可能无法实现其冷冻保护的作用，但是浓度过高则可能影响细胞活力甚至产生细胞毒性。因此选择最佳DMSO浓度对于发挥其冷冻保护剂的作用非常关键。

另一个重要因素是冷冻液中血清的使用。大多数细胞冻存液都是含有动物血清的，浓度范围从5％到90％不一。动物血清除了可以为细胞提供营养之外，在低温长期存储时还有稳定细胞膜、调整渗透压和避免自由基形成的作用。因此在干细胞冻存液中也有应用。但是对于临床使用的干细胞而言，动物血清的存在并不一定合适。首先，动物血清存在携带传播病原体及其他致病因素的风险；其次，由于血清的组分非常复杂、来源和生产批次存在差异可能会造成不良或不一致的影响；第三，血清中富含各种细胞因子、激素和其他活性成分，容易对干细胞的生物特性产生干扰和影响。因此，近年来对无血清干细胞冻存液的开发和探索也越来越受到重视。

目前常见的干细胞冻存液尚存在一些不足：1)专一性较高，普适性差，同一种冻存液在不同种类或不同种属来源干细胞的冻存保护效果差异较大；2)有血清冻存液成分复杂，容易产生干扰，且效应不可控；3)部分冻存液不适宜长期冻存，随冻存时间延长，细胞活力下降明显。

本发明即是在上述技术问题的技术上进行改进的。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在提出一种适用于神经干细胞和肿瘤干细胞的无血清干细胞冻存液，经实验室评价和实际应用测试，均说明该冻存液性能稳定，效果良好，是一种稳定有效的无血清干细胞冻存液。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种干细胞冻存液，包括DMSO、无血清培养基及其他成分，以体积百分含量计，其中DMSO占8-12％，无血清培养基为占总体积的83-87％，其他成分占3-8％，优选地，其他成分含量为5％。

进一步，所述无血清培养基为DMEM/F12:RPMI 1640，二者体积比为2:1。