[发明专利]人工合成的内含子、哺乳动物细胞重组表达载体、哺乳动物宿主细胞、表达方法及其应用

说明书

本发明涉及一种人工合成的内含子、哺乳动物细胞重组表达载体、哺乳动物宿主细胞、表达方法及其应用，属于生物技术领域。本发明利用人工合成的内含子，构建哺乳动物细胞重组表达载体，可以增强转录产物的稳定性，进而提高外源基因的表达量，降低哺乳动物细胞重组蛋白的生产成本。

技术领域

本发明涉及一种人工合成的内含子、哺乳动物细胞重组表达载体、哺乳动物宿主细胞、表达方法及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

重组蛋白在细菌、真核微生物、昆虫细胞等宿主中的表达虽然能获得较高的产量，但是这些表达系统缺少类似于哺乳动物细胞的翻译后蛋白质修饰机制的功能，例如准确的N型糖基化和O型糖基化等，这会导致表达的重组蛋白缺少生物活性或因折叠错误而产生包涵体。与其他系统相比，哺乳动物表达系统的优势在于能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的糖基化等多种翻译后加工功能，正因为这些优势的存在使得表达产物在分子结构、理化性质和生物学功能方面非常接近于天然的高等生物蛋白质分子。

外源蛋白质在哺乳动物细胞中的表达量受很多因素的影响，如表达载体的调控元件、转录和翻译控制因子、转基因拷贝数、mRNA的稳定性、外源基因在染色体上的整合位点、重组蛋白对宿主细胞的潜在毒性和宿主细胞的基因组偏好性等。真核生物基因的内含子在真核生物基因表达调控中起着重要的作用，是转基因研究中提高外源基因表达的重要元件之一。内含子能促进转录的起始或延伸、增加mRNA在核内的稳定性。

申请公布号为CN 105793415A的中国发明专利申请公开了CHO细胞的合成启动子、使用转录因子结合位点模块生产合成启动子的方法，但是目前并未见内含子元件对哺乳动物细胞转基因表达影响的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种人工合成的内含子，该人工合成的内含子可以增强转录产物的稳定性，进而提高哺乳动物宿主细胞中外源蛋白的分泌表达。

本发明还提供一种哺乳动物细胞重组表达载体，该重组表达载体含上述人工合成的内含子，可以提高外源蛋白质的表达水平。

另外，本发明提供一种哺乳动物宿主细胞，该哺乳动物宿主细胞含上述哺乳动物细胞重组表达载体，可以提高哺乳动物宿主细胞中外源蛋白的分泌表达。

此外，本发明还提供一种哺乳动物细胞表达外源蛋白的表达方法，通过该方法能够提高目的蛋白表达水平，降低生产成本。

最后，本发明提供一种人工合成的内含子、哺乳动物细胞重组表达载体、或者哺乳动物宿主细胞在提高哺乳动物细胞重组蛋白表达水平中的应用。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种人工合成的内含子，所述人工合成的内含子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该人工合成的内含子可以成倍提高外源蛋白在哺乳动物细胞的表达量。

一种哺乳动物细胞重组表达载体，所述哺乳动物细胞重组表达载体含有上述人工合成的内含子的核苷酸序列。该哺乳动物细胞重组表达载体可以使EGFP基因表达量提高3～5倍，使阿达木抗体表达量提高1～2倍，进而降低了哺乳动物细胞生产重组蛋白的成本。

上述人工合成的内含子的核苷酸序列位于哺乳动物细胞重组表达载体启动子的下游。内含子是真核基因的外显子间隔序列，因此在构建表达载体时内含子位于启动子下游。

上述哺乳动物细胞重组表达载体启动子为CMV、SV40、EF-1α、CAG中的任意一种。上述启动子是哺乳动物细胞重组表达载体常用的启动子。

一种哺乳动物宿主细胞，所述哺乳动物宿主细胞由上述哺乳动物细胞重组表达载体转染得到。该哺乳动物宿主细胞通过大规模培养可获得高表达量的外源蛋白质。

上述哺乳动物宿主细胞为CHO、HEK293、BHK或SP2/O。所述哺乳动物宿主细胞为研究动物细胞表达系统的常用细胞，其培养方式简单，易于大规模培养。