[发明专利]一种提高鱼鳞明胶品性的方法

说明书

本发明公开了一种提高鱼鳞明胶品性的方法。在大肠杆菌中高效表达脯氨酸羟基化酶(L‑proline cis‑4‑hydroxylase，P4H)并将其用于鱼鳞明胶改性，从而提高明胶的品性以扩大其在市场的应用范围。

技术领域

本发明涉及利用基因工程技术高效表达脯氨酸羟基化酶(L-proline cis-4-hydroxylase，P4H)并利用其对来源于鱼鳞的明胶进行改性，从而提高其品性的方法。

背景技术

食用明胶(gelatin)是胶原的水解产物，是一种无脂肪的高蛋白，不含胆固醇，且是一种天然营养型食品增稠剂。明胶作为一种强有力的保护胶体，具有较强的乳化力，能有效抑制牛奶、豆浆等蛋白质进入胃后因胃酸作用而引起的凝聚反应，有利于提高食物消化能力。明胶除了在食品领域具有广泛应用外，在医药、化妆品、照相等领域亦发挥着其特殊的功能。目前，工业上应用的明胶大部分来源于哺乳动物，如猪皮、牛皮、猪骨、牛骨等。但近年疯牛病和口蹄病等哺乳动物传染疾病的肆意传播，导致哺乳动物明胶的安全性受到广大消费者的普遍质疑；另因宗教信仰等原因使得哺乳动物明胶在某些食品中的应用亦受到一定限制。因此开发非哺乳动物来源的明胶具有重要的现实意义。

我国是淡水水产品养殖大国，淡水水产品产量居世界第一。随着直接食用和加工量的不断增加，淡水水产品消耗量呈现逐年增长趋势，为提高水产品的附加值，尤其是提高废弃鱼鳞的再利用，开发来源于非哺乳动物的明胶以满足社会需求的研究受到越来越多的科技工作者关注。但与哺乳动物来源的明胶相比，鱼鳞明胶(scale gelatin,SG)由于亚氨基酸—羟脯氨酸含量相对偏低，使其明胶没有足够的羟基与水形成氢键来稳定明胶的三联体螺旋结构，导致明胶胶融温度及强度等品性不及哺乳动物明胶。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于高效表达P4H并利用其对水产品来源的明胶进行改性，使鱼鳞明胶品性得到提升。

本发明实现目的的技术方案如下。

一种提高鱼鳞明胶品性的方法，包括以下步骤：

(1)将含有P4H编码基因的微生物的DAN序列除去终止密码子；

(2)在除去了终止密码子的P4H编码基因的两端分别加上限制性酶切位点；

(3)以表达质粒作为载体，采用限制性内切酶将P4H的编码基因及载体进行消化产生互补的粘性末端，再在连接酶的作用下连接起来构建重组质粒；

(4)将重组质粒转入感受态宿主中，筛选阳性克隆子，进行诱导高效表达P4H；

(5)分离纯化P4H；

(6)将鱼鳞明胶溶解于缓冲液中，加入纯化的P4H，并加入所需的其他物质，混匀并在一定温度下反应一段时间，然后灭活，得到改性的鱼鳞明胶。

所述鱼鳞明胶是由水产品废弃物鱼鳞加工而成的明胶；鱼鳞可以来自淡水鱼，也可来自海鱼。

在步骤(1)中，含有P4H编码基因的微生物是荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)。

在步骤(2)中，限制性酶切位点可以是XhoI和EcoRI限制性酶切位点。

在步骤(3)中，可以选择pET-28(a)等质粒作为表达载体。

在步骤(4)中，可以通过热激方法将重组质粒转入感受态宿主大肠杆菌(Escherichia coli)或E.coli–Roestta中，采用抗性、菌落PCR筛选阳性克隆子。

在步骤(5)中，可以采用Ni柱进行亲和层析纯化。