[发明专利]一种基于胍基化标记的蛋白质N端肽段反向富集的方法

权利要求书

1.一种基于胍基化标记的蛋白质N端肽段反向富集的方法，包括：赖氨酸ε-氨基及多肽N端氨基的胍基化标记、胍基化试剂的去除，胍基化赖氨酸C端肽键的胰蛋白酶酶切及非蛋白质N末端肽段的选择性去除。

2.按照权利要求1的方法，其特征在于：胍基化标记过程为，

1)使用1H-吡唑-1-甲脒作为胍基化标记试剂(不仅能够对赖氨酸ε-氨基进行胍基化标记，而且能够实现肽段及蛋白质的N端氨基进行高效标记)；

2)使用1H-吡唑-1-甲脒进行高效胍基化标记的浓度为2mM-2M，反应加入氢氧化钠、三乙胺、二异丙基乙基氨等中的一种或二种以上不含自由氨基的碱调节pH为9-12，反应温度为25℃-99℃，反应时间为10min-24h。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：对胍基化试剂的去除过程为，可以利用蛋白质变性沉淀或者滤膜过滤方法将多余的胍基化试剂去除；

1)沉淀法出去胍基化标记试剂：利用氯仿-甲醇沉淀、三氟乙酸沉淀、或丙酮沉淀等方法将蛋白质变性沉淀，将蛋白质与多余的胍基化试剂分离，实现胍基化试剂的去除；

2)滤膜过滤法去除胍基化试剂：使用具有5kDa、10kDa或30kDa滤膜的离心管截留蛋白质，而胍基化试剂通过滤膜，实现蛋白质与多余胍基化试剂的去除。

4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：胍基化赖氨酸C端肽键的胰蛋白酶酶切过程为，利用蛋白质变性沉淀或者滤膜过滤方法，将胍基化试剂去除；将胍基化标记的蛋白质样品重溶解在包括4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、磷酸缓冲盐溶液(PBS)、三乙胺-碳酸缓冲液(TEAB)等中的一种或二种以上不含有自由氨基的缓冲液中，胰蛋白酶用量为蛋白质质量的1/5-1/500，调节pH至6.5-9.5，在20-50℃酶解2-48h。

5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：利用氨基活性材料选择性去除非N末端肽段过程为，

1)氨基反应活性材料包括包括N-羟基琥珀酰亚胺酯活性琼脂糖、溴化氰活性琼脂糖、异氰酸树脂、醛基功能化材料、十一醛、十六醛、超支化聚甘油醛(HPG-ALD)等中的一种或二种以上，调节pH为2-13，15-95度反应10min至24h；

2)氨基活性材料上多余活性基团的终止：使用含有自由氨基的试剂如氨水、碳酸氢铵、乙醇胺、Tris-Cl等中的一种或二种以上与氨基活性材料上活性基团反应，中和多余的活性基团，氨基自由试剂使用浓度为1mM-1000mM，15-95度反应5min至4h；

3)纯化蛋白质N末端肽段：根据材料的性质，可以使用离心、亲和色谱、滤膜等方法中的一种或二种以上将氨基活性材料与没有反应的蛋白质N末端肽段分开。

6.按照权利要求1所述的方法，对富集产物进行质谱分析，为增强离子化效率，包括在电喷雾离子化(ESI)、离子喷雾离子化(ISI)、大气压化学离子化(APCI)或基质辅助激光解吸离子化(MALDI)等离子化效率的增强。

7.按照权利要求1所述的方法，对富集产物进行质谱分析，为提高肽段的二级谱图质量，包括在诱导碰撞解离(Collision Induced Dissociation：CID)、高能碰撞解离(HigherEnergy Collision Dissociation：HCD)、或电子转移解离(Electron TransferDissociation:ETD)等碰撞产生的二级谱图。

8.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：胍基化标记的标记对象是蛋白质及氨基酸。

9.按照权利要求1所述的方法，其来源包括：胍基化标记的组织、细胞、血浆、标准蛋白等各种来源的含有氨基的样品中的一种或二种以上。