[发明专利]一种应用酵母表达系统表达可溶性生长刺激表达基因2蛋白的方法

权利要求书

1.一种应用酵母表达系统表达可溶性生长刺激表达基因2（sST2）蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）表达可溶性生长刺激表达基因2蛋白的酵母菌种的构建

人工合成编码sST2融合蛋白的DNA序列，合成时在其C端引入6个组氨酸标签，在N端和C端预留酶切位点，所述的编码sST2融合蛋白的DNA序列如SEQ ID NO.1所示，目的片段和载体经过双酶切后进行连接，构建含有可溶性生长刺激表达基因2的重组质粒；质粒先进行线性化，然后通过电转的方式转入酵母菌感受态中，构建得到表达可溶性生长刺激表达基因2蛋白的酵母菌种；其中，所述的载体为pPIC9K载体，所述的酵母菌为GS115 毕赤酵母表达菌；

2）将构建得到的表达可溶性生长刺激表达基因2蛋白的酵母菌种在MD平板上划线接种，挑取单菌落接种至20ml YPD培养基，160rpm 30℃震荡培养24h，达到对数生长期，作为一级种子；将一级种子按1：100接种至400ml的BMGY培养基中160rpm 30℃震荡培养24h，待OD600达到6时即可作为二级种子；选择5L发酵罐，发酵罐中预先装入2L的初始BMGY培养基并灭菌；灭菌结束后，无菌加入300ml MgSO4，300ml 10*YNB，标定溶氧为100%，加入准备好的400ml二级种子开始发酵；0-96 h 始终保持30℃，PH始终保持6.0，0-22h补甘油248ml，流速控制在11.27ml/min，0-7h DO和转速串联，保证DO30%，转速控制在200-800rpm之间，7h后取消串联，改为自动布控，每小时增加转速50rpm，达到800rpm后维持至发酵结束；发酵24h后补加混合氮源，24h-72h流速控制在1ml/h/L，72h-96h控制流速在1.2ml/h/L；发酵24h开始甲醇诱导，24h-27h控制流速在1ml/h/L，27h-29h控制流速在2ml/h/L，29h-48h控制流速在3ml/h/L，48h-60h控制流速在4ml/h/L，60h-66h控制流速在4.5ml/h/L，66h-72h控制流速在5ml/h/L，72h-96h控制流速在5.5ml/h/L直至发酵结束；发酵48h时，转速调至950rpm/min，保证DO≥30%，直至发酵结束；

3）纯化

对收集的上清采用超滤浓缩、Ni柱亲和纯化以及SP柱捕获的方法进行蛋白的纯化，得到纯化后的可溶性生长刺激表达基因2蛋白；

所述的超滤浓缩是将发酵上清用0.8um、0.45um和0.22um的滤膜过滤，选择50cm² 10kD膜包，膜包用去离子水冲洗后，加入滤好的样品，将样品的体积浓缩到50-100ml，浓缩样品用2L的超滤缓冲液（0.15M PBS，pH7.4）平衡洗涤至透过液无色，最终保证样品终体积小于100ml，收集置换过缓冲液的样品，添加0.05w/v%NaN₃，2-8℃短期保存；

所述的Ni柱亲和纯化是选择5 ml Ni柱，A液为0.15M PBS pH7.4，B液为0.15M PBS+0.5M咪唑 pH7.4；预先用A液平衡Ni柱，将超滤处理过的酵母上清上样，上样完成后用A液再次平衡，然后依次用5%B液、25%B液、50%B液和100%B液洗脱，收集洗脱峰；

所述的SP柱捕获是将SP柱预先用10mM PB pH6.0平衡，平衡好后将收集的样品洗脱峰上样，一步100% pH6.0含1M NaCl的10mM PB溶液洗脱，收集洗脱峰。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括对纯化后的纯化后的可溶性生长刺激表达基因2蛋白进行活性检测的步骤：在ELISA板上包被IL-33，然后加入梯度稀释的纯化后的可溶性生长刺激表达基因2蛋白，用HRP标记的ST2单抗进行检测。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，IL-33的包被浓度为2µg/ml。