[发明专利]一种鸭坦布苏报告病毒的制备方法及其产品和应用

说明书

本发明中公开了一种鸭坦布苏报告病毒的制备方法及其产品和应用，通过CQW1毒株(GenBank：KM233707.1)的反向遗传操作系统，对鸭坦布苏病毒基因组的第1‑2646核酸片段进行改造，将NanoLuc报告基因插入到TMUV病毒的5’UTR和结构基因之间，构建报告病毒的全长cDNA感染性克隆。本发明对报告病毒的构建进行优化，并更换报告基因，从而有效提高报告病毒的传代稳定性，拯救出的报告病毒在5代以内不会丢失报告基因；同时减少构建重组质粒时所使用的引物及扩增基因片段的数量，减少反应步骤，简化工序，方便操作，有效的缩短了获得报告病毒的周期，降低了生产成本。

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，尤其涉及一种鸭坦布苏报告病毒的制备方法及其产品和应用。

背景技术

鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus，DTMUV)病自2010年首次爆发以来，给我国的养鸭产业造成了巨大的经济损失。几乎所有品种的鸭都能感染鸭坦布苏病毒，包括樱桃谷鸭、北京鸭、麻鸭等，其主要临床症状为：体温升高、食欲显著下降，四肢无力、瘫痪；产蛋大幅下降，排草绿色稀便，气味恶臭；雏鸭感染后以瘫痪、头颈震颤为特征。种鸭感染后，其特征性病变为卵泡膜出血，卵泡变形甚至破裂，所以该病曾被称为“出血性卵巢炎”，蛋鸭产蛋量大幅度下降甚至停止产蛋，严重者能够导致死亡，死亡率可以达到10％-30％。剖检时可以见到脾脏明显肿大，另外部分鸭肝脏出血严重，并同时伴有针尖状白色坏死点；卵巢病理变化非常严重，出血、萎缩、破裂，输卵管有大量粘液。此外，有报道鸡、鹅、麻雀等也能感染该病。

目前的研究对DTMUV的研究并不深入，报道主要集中与病毒的分离鉴定和宿主的免疫反应等。其致病机制，免疫逃避等分子机制，各种蛋白的结构功能还有待于进一步的研究，才能确定与其他黄病毒属是否一致，是否存在差异性，而有关鸭坦布苏病毒的各个蛋白的作用也还有待深入的研究与证明。由于当前对该病的防控措施尚不完善，因此，该病每年仍对我国养鸭业造成几十亿元的经济损失，切实安全、高效的DTMUV疫苗亟待研制和应用。

DTMUV属黄病毒属，黄病毒的报告病毒自首次报道以来的十多年来，不同种属的黄病毒的多种类型的报告病毒已经被成功构建，并被广泛应用于研究病毒的生命周期，复制机制，抗病毒研究，药物筛选等领域，成为研究黄病毒的前有力的工具。构建黄病毒的报告病毒依赖于黄病毒的反向遗传操作系统，通过感染性克隆技术，将外源的报告基因插入到病毒基因组的合适位置，从而拯救出能表达报告基因的具有增殖能力的报告病毒。目前，包括EGFP，mCherry,Renilla luciferase,FireFly luciferase等报告基因都被尝试用于构建报告病毒，但通常报告基因的插入会致弱病毒的复制，且一般来说，报告基因越大，在传代过程中丢失就越快。值得注意的是，报告病毒的稳定性是相对而言，即便是最稳定的报告病毒在长期传代过程中，最终都会回复成野生型病毒，但是获得的报告病毒越稳定，传代数越多，越适合用于对病毒的生命周期、复制机制、抗病毒等方面的研究。

中国发明专利CN107475294A公布了携带海肾荧光素酶的鸭坦布苏报告病毒的制备方法及其产品和应用，该发明方法中将海肾荧光素酶的基因插入到TMUV病毒的5’UTR和结构基因之间，构建出了重组质粒，再用高质量的自动加帽的T7体外转录试剂盒，获得报告病毒的转录RNA后转染BHK21细胞拯救出报告病毒。但是实践发现，该专利方法所获得的DTMUV报告病毒极不稳定，在第2代或者第3代就已经检测到报告基因的明显丢失了；在5代以内，报告基因几乎完全丢失回复成野生型病毒，非常不利于后续研究的开展。而且该专利方法比较复杂，涉及多对引物的设计使用、多条基因片段的扩增及多个重组质粒的克隆，最后才能得到报告病毒的质粒载体，操作复杂，得到报告病毒的周期比较长。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中存在的以上问题，提供一种鸭坦布苏报告病毒的制备方法及其产品和应用，对报告病毒的构建进行优化，并更换报告基因，从而有效提高报告病毒的传代稳定性并且精简操作步骤，缩短获得报告病毒的周期。