[发明专利]一种定量检测窖泥中甲烷菌含量的方法在审
申请号: | 201811403485.3 | 申请日: | 2018-11-23 |
公开(公告)号: | CN109251989A | 公开(公告)日: | 2019-01-22 |
发明(设计)人: | 袁木;何宏魁;张治洲;蔡照润;曹润洁;李安军 | 申请(专利权)人: | 哈尔滨工业大学(威海) |
主分类号: | C12Q1/689 | 分类号: | C12Q1/689;C12Q1/04;C12Q1/686;C12R1/01 |
代理公司: | 北京汇捷知识产权代理事务所(普通合伙) 11531 | 代理人: | 李宏伟 |
地址: | 264209 山*** | 国省代码: | 山东;37 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 甲烷菌 特异性引物 窖泥 定量检测 浓香型白酒 样本 单核苷酸多态性 分子生物学 基因组样本 特异性PCR 宏基因组 技术设计 食品发酵 分类 菌群 扩增 引物 生物技术 采集 检测 | ||
1.一种定量检测浓香型白酒窖泥中甲烷菌的方法,其特征在于该方法包含以下步骤:
(1)目标甲烷菌特异性引物的设计;
(2)不同窖泥样本的采集及其宏基因组提取;
(3)利用目标甲烷菌特异性引物对上述基因组样本进行QPCR扩增来定量检测不同样本中甲烷菌的含量。目标甲烷菌或目标甲烷菌属这里指六个分类层面(门纲目科属种)任意一个层面上的一组甲烷菌均可以。菌属字眼只是通俗的称谓,并不局限于属这个分类层面。
2.根据权利要求1中所述的方法,其特征在于目标甲烷菌特异性引物,其设计方法如下:以浓香型白酒窖泥中某个特定的的甲烷菌属为研究对象,经过对窖泥中含量最多的前三十个菌属的16SrRNA全长代表序列、目标甲烷菌属的16SrRNA全长代表序列和数据库搜索挑选的目标甲烷菌属16SrRNA全长其他序列使用MAFFT(MultipleAlignmentusingFastFourierTransform,https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/mafft/)多序列比对分析,找出目标甲烷菌属的全部singlenucleicpolymorphism(SNP)位点。对全部SNP位点进行目标甲烷菌属内和菌属外可行性验证,找出3-5个最好的SNP位点,以此基础上再选择最佳的一个SNP位点进行特异性引物设计。原则上可以设计多对目标甲烷菌属特异性引物。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,使用SNP位点和扩展性SAP(simpleallelediscriminatingPCR)方法设计引物。根据SAP理论的一般设计方法,引物的3’端末端应该是SNP位点,在SNP位点的前一位点(引物的倒数第二位)人为的引入错配,这样一来引物与靶序列(目标甲烷菌属)只有在倒数第二位有错配,而与非靶序列在最后两个碱基位点都是错配。如此就可以通过合适的扩增条件使得非靶序列不能得到有效的扩增。本专利基于该理论在错配的位置做了稍许扩展性调整,即SNP位点只需要放置在引物3’端的末2位(不一定是最后一位,可以是倒数第二位),错配位置也放在末位,不一定是倒数第二位(也可以是倒数第三位附近),宗旨是让引物与靶序列在引物的3’末端2-4个碱基的配对强度大于非靶序列即可。引物的特异性经过PCR扩增及产物测序验证,确定特异性无误的引物可以进一步用于QPCR(quantitativePCR)再验证,要求QPCR的熔接曲线为单峰且没有明显的二聚体扩增。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,依据上述方法为一组特定的甲烷菌(甲烷囊菌属)设计了两对引物,其核苷酸序列为:
Met1-f5’-TCACCAGAACGGCTTCGATAGT-3’,
Met1-r5’-GCGAGTTACAGCCCACAATCC-3’;
Met2-f5’-CGGAGTTGGATTCTGAGACACG-3’,
Met2-r5’-CCAGCTTTCGTCCTTCGCT-3’。
5.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述应用的领域为食品发酵领域。
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