[发明专利]一种定量检测窖泥中甲烷菌含量的方法

权利要求书

1.一种定量检测浓香型白酒窖泥中甲烷菌的方法，其特征在于该方法包含以下步骤：

(1)目标甲烷菌特异性引物的设计；

(2)不同窖泥样本的采集及其宏基因组提取；

(3)利用目标甲烷菌特异性引物对上述基因组样本进行QPCR扩增来定量检测不同样本中甲烷菌的含量。目标甲烷菌或目标甲烷菌属这里指六个分类层面(门纲目科属种)任意一个层面上的一组甲烷菌均可以。菌属字眼只是通俗的称谓，并不局限于属这个分类层面。

2.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于目标甲烷菌特异性引物，其设计方法如下：以浓香型白酒窖泥中某个特定的的甲烷菌属为研究对象，经过对窖泥中含量最多的前三十个菌属的16SrRNA全长代表序列、目标甲烷菌属的16SrRNA全长代表序列和数据库搜索挑选的目标甲烷菌属16SrRNA全长其他序列使用MAFFT(MultipleAlignmentusingFastFourierTransform，https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/mafft/)多序列比对分析，找出目标甲烷菌属的全部singlenucleicpolymorphism(SNP)位点。对全部SNP位点进行目标甲烷菌属内和菌属外可行性验证，找出3-5个最好的SNP位点，以此基础上再选择最佳的一个SNP位点进行特异性引物设计。原则上可以设计多对目标甲烷菌属特异性引物。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使用SNP位点和扩展性SAP(simpleallelediscriminatingPCR)方法设计引物。根据SAP理论的一般设计方法，引物的3’端末端应该是SNP位点，在SNP位点的前一位点(引物的倒数第二位)人为的引入错配，这样一来引物与靶序列(目标甲烷菌属)只有在倒数第二位有错配，而与非靶序列在最后两个碱基位点都是错配。如此就可以通过合适的扩增条件使得非靶序列不能得到有效的扩增。本专利基于该理论在错配的位置做了稍许扩展性调整，即SNP位点只需要放置在引物3’端的末2位(不一定是最后一位，可以是倒数第二位)，错配位置也放在末位，不一定是倒数第二位(也可以是倒数第三位附近)，宗旨是让引物与靶序列在引物的3’末端2-4个碱基的配对强度大于非靶序列即可。引物的特异性经过PCR扩增及产物测序验证，确定特异性无误的引物可以进一步用于QPCR(quantitativePCR)再验证，要求QPCR的熔接曲线为单峰且没有明显的二聚体扩增。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，依据上述方法为一组特定的甲烷菌(甲烷囊菌属)设计了两对引物，其核苷酸序列为：

Met1-f5’-TCACCAGAACGGCTTCGATAGT-3’，

Met1-r5’-GCGAGTTACAGCCCACAATCC-3’；

Met2-f5’-CGGAGTTGGATTCTGAGACACG-3’，

Met2-r5’-CCAGCTTTCGTCCTTCGCT-3’。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用的领域为食品发酵领域。