[发明专利]MIF和TIPE2双基因共表达重组腺病毒及其制备方法和应用

权利要求书

1.MIF和TIPE2双基因共表达重组腺病毒，其特征在于：所述重组腺病毒基因组中包含一个MIF和TIPE2双基因表达盒，所述MIF和TIPE2双基因表达盒由上游至下游依次包含EF1α启动子、MIF基因、终止子、内部核糖体进入位点IRES、TIPE2基因和终止子。

2.权利要求1所述MIF和TIPE2双基因共表达重组腺病毒的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：

a、RT-PCR扩增MIF cDNA全长；

b、RT-PCR扩增TIPE2 cDNA全长；

c、将步骤a所得MIF cDNA全长插入pEGFP载体的IRES上游，步骤b所得TIPE2 cDNA全长插入pEGFP载体的IRES下游，得重组载体pEGFP-MIF-IRES-TIPE2；

d、以步骤c所得重组载体pEGFP-MIF-IRES-TIPE2为模板，PCR扩增MIF-IRES-TIPE2片段并更换该片段两端的酶切位点；

e、将步骤d所得MIF-IRES-TIPE2片段插入腺病毒穿梭载体pShuttle-EF1α的EF1α启动子下游，得重组腺病毒穿梭载体pShuttle-EF1α-MIF-IRES-TIPE2；

f、将步骤e所得重组腺病毒穿梭载体pShuttle-EF1α-MIF-IRES-TIPE2与腺病毒骨架载体pAdEasy-1在大肠杆菌o157中进行胞内同源重组，得重组腺病毒载体pAd-MIF/TIPE2；

g、将重组腺病毒载体pAd-MIF/TIPE2在293细胞中包装成重组腺病毒Ad-MIF/TIPE2。

3.根据权利要求2所述MIF和TIPE2重组腺病毒的制备方法，其特征在于：步骤a的具体方法为：提取人肝组织总RNA，逆转录得到cDNA，再以该cDNA为模板，以SEQ ID No.1和SEQID No.2所示序列为上下游引物，PCR扩增两端分别带有HindIII和BamHI酶切位点的MIFcDNA全长，PCR条件为：94℃预变性4分钟；然后94℃变性45秒，58℃退火60秒，72℃延伸1分钟，共30个循环；最后72℃延伸5分钟；PCR产物经纯化后克隆入pT-Easy载体，得重组载体pT-MIF。

4.根据权利要求3所述MIF和TIPE2重组腺病毒的制备方法，其特征在于：步骤b的具体方法为：提取人胰腺组织总RNA，逆转录得到cDNA，再以该cDNA为模板，以SEQ ID No.4和SEQID No.5所示序列为上下游引物，PCR扩增两端分别带有BamHⅠ和NotI 酶切位点的TIPE2cDNA全长，PCR条件为：94℃预变性4分钟；然后94℃变性45秒，58℃退火60秒，72℃延伸1分钟，共30个循环；最后72℃延伸5分钟；PCR产物经纯化后克隆入pT-Easy载体，得重组载体pT-TIPE2。

5.根据权利要求4所述MIF和TIPE2重组腺病毒的制备方法，其特征在于：步骤c的具体方法为：自重组载体pT-MIF中用HindIII和BamHI双酶切出MIF cDNA全长，经纯化后与同样用HindIII和BamHI双酶切的pEGFP载体连接，得重组载体pEGFP-MIF；再自重组载体pT-TIPE2中用BamHⅠ和NotI 双酶切出TIPE2 cDNA全长，经纯化后与同样用BamHⅠ和NotI 双酶切的重组载体pEGFP-MIF连接，得重组载体pEGFP-MIF-IRES-TIPE2。

6.根据权利要求5所述MIF和TIPE2双基因共表达重组腺病毒的制备方法，其特征在于：步骤d的具体方法为：以重组载体pEGFP-MIF-IRES-TIPE2为模板，SEQ ID No.7和SEQ IDNo.8所示序列为上下游引物进行PCR，将MIF-IRES-TIPE2片段两端的酶切位点更换为NotI酶切位点和NotⅠ酶切位点，PCR条件为：94℃预变性4分钟；然后94℃变性45秒，58℃退火60秒，72℃延伸1分钟，共30个循环；最后72℃延伸5分钟；PCR产物经纯化后克隆入pT-Easy载体，得重组载体pT-MIF-IRES-TIPE2。