[发明专利]一种重组减毒沙门氏菌LH430及其制备方法和用途

说明书

本发明公开了一种重组减毒沙门氏菌LH430及其制备方法和用途，利用蜂毒肽MEL基因和肿瘤靶向肽RGD基因，将目的基因克隆到pMD‑18‑T载体中，线性化重组穿梭载体后构建重组真核表达载体pEGFP‑RGD‑MEL，将其转化至感受态LH430，构建了包含上述目的基因的重组减毒沙门氏菌LH430；用重组减毒沙门氏菌LH430侵染黑色素瘤细胞B16，使其表达RGD‑MEL基因；评价RGD‑MEL基因共表达的减毒沙门氏菌LH430对B16细胞的抑瘤效果。

技术领域

本发明涉及构建重组减毒沙门氏菌的方法，具体说，是一种利用RGD和MEL基因导入减毒沙门氏菌LH430获得的重组减毒沙门氏菌LH430及其制备方法和用途。

背景技术

黑色素瘤(melanoma)是死亡率极高的皮肤恶性肿瘤，在兽医临床上常见于老龄动物(尤以犬多发)，在全球范围内发病率呈逐年上升趋势。其特点是恶性程度高、进展快，易远处转移，是一种对常规治疗药物具有较强的抗性，临床治疗过程中颇为棘手的恶性肿瘤，对食品卫生和公共安全构成极大的危害。由于以上的种种原因，使得研究者们亟需一种新的研究策略来治疗恶性黑色素瘤。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种利用RGD和MEL基因导入减毒沙门氏菌LH430获得的重组减毒沙门氏菌LH430及其制备方法和用途，将RGD对肿瘤细胞的靶向性、MEL基因的细胞凋亡作用和减毒沙门氏菌LH430可有效携带外源基因或递呈肿瘤治疗因子靶向于肿瘤厌氧区、安全可靠、有细胞凋亡作用的特性结合起来，构建出能够融合表达上述基因的重组减毒沙门氏菌，检验RGD-MEL基因在减毒沙门氏菌LH430携带下对B16细胞的抑瘤作用。为进一步利用重组减毒沙门氏菌在体内外诱导肿瘤细胞凋亡，细胞穿膜肽和细菌联合治疗肿瘤，以及广谱型肿瘤疫苗的研制提供一些理论和实践的依据。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种重组减毒沙门氏菌LH430的制备方法，包括以下步骤：

1)根据蜂毒肽基因序列GI:AY745248.1优化得到的在小鼠体内高效表达的MEL基因SEQ ID NO.6；根据肿瘤靶向肽蛋白序列PI:1FUL_A和蜂毒肽基因序列GI:AY745248.1优化得到的在小鼠体内高效表达的RGD-MEL基因SEQ ID NO.5；

2)MEL基因、RGD-MEL基因PCR扩增：以MEL-F SEQ ID NO.1和MEL-R SEQ ID NO.2为引物，扩增MEL基因；以RGD-MEL-F SEQ ID NO.3和RGD-MEL-R SEQ ID NO.4为引物，扩增RGD-MEL基因；

3)将获得的目的基因克隆到pMD-18-T载体中，线性化重组穿梭载体后构建重组真核表达载体pEGFP-RGD-MEL，并用其转化感受态LH430，构建了包含上述目的基因的重组减毒沙门氏菌LH430。

上述重组减毒沙门氏菌LH430的制备方法获得的重组减毒沙门氏菌LH430。

上述重组减毒沙门氏菌LH430的制备方法获得的重组减毒沙门氏菌LH430在制备防治小鼠黑色素瘤生物制品方面的应用。