[发明专利]木薯U6启动子基因及应用

说明书

本发明公开了3个木薯U6启动子基因及应用，该3个启动子序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示，通过GUS染色瞬时表达验证，能高效的在木薯上表达。在转基因技术领域，这些启动子不仅适用于木薯，除用于启动功能基因表达外，在构建RNAi表达载体时可用于启动发夹结构的表达，在CRISPR/Cas9系统中可用于启动sgRNA引导序列的表达等。

技术领域

本发明属生物技术领域，特别是植物转基因技术领域，具体涉及木薯U6启动子的克隆和应用。

背景技术

木薯(Manihot esculenta Crantz)属大戟科(Euphorbiaceae)木薯属(ManihotP.Mill.)植物，是世界三大薯类(木薯、甘薯和木薯)作物之一，同时也是热带地区继水稻、玉米、高粱之后的第四大粮食作物，是热带和亚热带地区重要的热能来源，为世界上近6亿人提供食物。木薯广泛分布于全球南、北纬30°之间的热带及部分亚热带地区。我国木薯主产区有海南、广东、广西、福建、云南，在四川、贵州、湖南、江西、浙江等地也有种植。木薯对光、热和水资源的利用非常高，单位面积生物能产量几乎高于其它栽培作物，具有抗旱、耐贫瘠、适应性广以及储藏根(块根)淀粉含量高(占干重的85％)等独特而优良的生物学特性。木薯淀粉是食品加工、工业变性淀粉、饲料和生物质产品(燃料乙醇)的重要原料。木薯已有几千年的栽培历史，因植株基因型高度杂合、基因冗余、花粉育性低、有性子代严重分离等自身特征和种质资源的局限性，其常规育种困难且进展较慢。

近年来，通过转基因途径改良木薯品种获得阶段性进展，例如在降低氰化物、提高块根淀粉含量、改良直(支)淀粉比例以及抗病、耐寒、抗旱转基因育种都取得良好进展。尽管如此，木薯转基因育种仍然存在不少亟待解决的问题。其中，挖掘适合木薯本身的特异启动子。目前广泛用于木薯的启动子是CaMV35s，CaMV35s并不适宜驱动块根基因的表达。虽然已有马铃薯块茎patatin蛋白特意启动子、Pt214等相继用于木薯转化，但相较于水稻、小麦等粮食作物，木薯自身的启动子资源相对匮乏。

U6启动子是二型启动子，与真核生物RNA聚合酶III结合后，负责转录U6RNA，这类启动子的特点是几乎所有启动子元件(除了+1位的转录起点)都位于转录起始位点的上游，也即它对转录起点后的序列无特殊选择或要求，能保证转录序列的结构特征。U6启动子+1位是鸟苷酸。RNA聚合酶III启动子识别的终止信号是连续4-5个胸苷酸，转录产物末端一般有4个尿苷酸。几乎所有的真核生物都具有U6启动子，U6启动子在真核生物体内一般发现是启动小片段，不带PolyA尾的序列，由RNA聚合酶III聚合U6启动子转录产生shRNA，经剪切后产生成熟siRNA，产生干扰效果；shRNA的表达量取决于启动子的强弱，与同类的RNA聚合酶III的启动子H1相比，U6启动子启动能力更强，表达时间也长。

目前，在转基因技术领域，U6启动子多用在构建RNAi表达载体上，用于启动干扰发夹结构的表达；此外，随着基因编辑技术的兴起，U6启动子也被开始广泛用于CRISPR系统中sgRNA引导序列的启动表达，以保证引导序列的结构特征。U6启动子具有种属特异性，在转基因技术中，使用转化物种本身或接近物种的U6启动子能取得更高的的启动效率。前人研究表明，人U6启动子有几个明显的特点：1、具有TATA box，位于-30～-25bp，被Pol III转录；2、在转录起点上游-66～-47bp处存在PSE(proximal sequence element)，该元件是snRNA 激活因子蛋白复合物的结合位点；3、在-244～-214存在DSE(distal sequenceelement)；4、启动子下游存在5'-TTTT-3'序列为Pol III提供转录终止信号；5、PSE和DSE之间的距离变化可显著影响转录效率；6、+1位的G对转录效率影响较大。根据这些特点，在使用U6启动子构建RNAi表达载体时，U6启动子的长度最好在300bp左右，尽量不改变PSE和DSE的间距，同时保留TATA box和+1位的G，在下游应有5'-TTTTT-3'序列作为终止信号。另外可以根据需要在启动子上游或终止信号下游设计测序引物序列、酶切位点等等。