[发明专利]丙酮酸氧化酶的固定化方法

权利要求书

1.一种丙酮酸氧化酶的固定化方法，其特征在于，所述丙酮酸氧化酶Genbank序列ID为EF017806.1，所述方法包括如下步骤：

1）采用层层滴涂的修饰方法，将清洁的Pb电极置于硝酸和重铬酸钾的混合溶液中，利用循环伏安法扫描一圈，进行电化学氧化处理；

2）取30 mmol/L的碳二亚胺（EDC）溶液滴定于经电化学氧化处理的Pb电极表面，完成固定；

3）将固定EDC的电极置于质量浓度为0.06%~0.3%的聚赖氨酸溶液中，EDC和聚赖氨酸交联反应生成修饰膜；

4）将步骤3）获取的修饰电极在常温下干燥，之后将丙酮酸氧化酶酶液与EDC溶液混合后滴定于电极表面；

所述丙酮酸氧化酶酶液的获取方式如下：

1）将丙酮酸氧化酶基因序列连接至表达质粒，得到重组质粒；

2）将重组质粒转化至宿主菌，得到丙酮酸氧化酶生产菌；

3）将丙酮酸氧化酶生产菌接种于LB液体培养基中，培养过夜；培养液转接入LB液体培养基中发酵培养，再加入乳糖或异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导表达，离心收集菌体；

4）用PBS缓冲液洗涤步骤3）得到的菌体，离心，超声破碎，收集上清液，即为丙酮酸氧化酶粗酶液，纯化粗酶液获取丙酮酸氧化酶酶液。

2.根据权利要求1所述的丙酮酸氧化酶的固定化方法，其特征在于，所述步骤1）中，将清洁的Pb电极置于质量浓度10%的硝酸和质量浓度2.5%的重铬酸钾的混合溶液中，进行电化学氧化处理。

3.根据权利要求1所述的丙酮酸氧化酶的固定化方法，其特征在于，所述聚赖氨酸质量浓度为0.18%。

4.根据权利要求1所述丙酮酸氧化酶的固定化方法，其特征在于，所述的表达质粒为pET-28a；所述宿主菌为大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)。

5.根据权利要求1所述丙酮酸氧化酶的固定化方法，其特征在于，所述丙酮酸氧化酶粗酶液的纯化方法为：将得到的丙酮酸氧化酶粗酶液连接蠕动泵，通过Ni柱，用除杂溶液洗脱杂蛋白，收集洗脱液在超滤管中离心，得到纯化的丙酮酸氧化酶酶液。