[发明专利]GRP78蛋白双抗夹心ELISA法检测试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种GRP78蛋白双抗夹心ELISA法检测试剂盒，包括兔多克隆抗体、腹水型单克隆抗体、标准品GRP78蛋白、HRP标记的山羊抗兔IgG、显色液、终止液、封闭液和洗涤液。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述兔多克隆抗体由以下步骤制得：将GRP78蛋白用于新西兰兔背部皮下多点免疫4-5周，颈动脉采血后分离血清，辛酸-硫酸铵沉淀法纯化抗体后进一步DEAE离子交换层析法纯化得到兔多克隆抗体。

3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述腹水型单克隆抗体由以下步骤制得：将稳定分泌抗GRP78单抗的杂交瘤细胞株复苏，用加入15%胎牛血清的IMDM培养基培养杂家瘤细胞；用弗氏不完全佐剂腹腔注射预免疫雌性Balb/c小鼠，将杂交瘤细胞注射入Balb/c小鼠腹腔，每只杂交瘤细胞注射量控制在1-5×10⁵个，一周后收集小鼠腹水；将收集的腹水低温离心除去细胞和碎片，然后用0.45μm滤器过滤，纯化，得到腹水型单克隆抗体。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：以腹水型单克隆抗体作为捕获抗体，以兔多抗作为检测抗体。

5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：捕获抗体为单克隆抗体McAb-1。

6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述封闭液选自5%脱脂奶粉、5%BSA、2.5%BSA、1.25%BSA中的一种；每孔加样250ul，37℃恒温箱孵育，封闭时间为1-4h；酶标二抗孵育时间为37℃孵育20-60min，100ul/孔。

7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：封闭条件为5%脱脂奶粉37℃封闭2h，酶标二抗孵育时间为37℃孵育40min。

8.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述显色液为TMB显色液，100ul/孔，37℃恒温箱避光孵育，终止液为2mol/L硫酸，50ul/孔，洗涤液为PBST千分之一Tween20。

9.一种GRP78蛋白双抗夹心ELISA检测方法，按照双抗体夹心ELISA测抗原的方式，采用棋盘方阵滴定，以腹水型单克隆抗体McAb-1作为捕获抗体，以兔多抗作为检测抗体，与羊抗兔酶标二抗反应后，获取OD450值；然后根据以下标准曲线回归方程计算GRP78蛋白浓度；

y=0.263x - 1.114，

其中，y为OD450值，x为GRP78重组蛋白浓度的自然对数。

10.一种GRP78蛋白双抗夹心ELISA检测方法，按照双抗体夹心ELISA测抗原的方式，采用棋盘方阵滴定；其特征在于：将单克隆抗体McAb-1作为捕获抗体分别稀释至10μg、5μg、2.5μg、1.25μg /ml，100ul/孔包被酶标板，4℃孵育过夜；洗涤液洗板4次后；加入封闭液250ul/孔，37℃恒温箱孵育；再次洗板4次后;分别与梯度稀释的重组GRP78蛋白反应，PBS作为阴性对照，上样量100ul/孔，37℃恒温箱孵育1h后，洗板4次；然后加入不同稀释浓度的检测抗体（兔多抗），稀释比例为1:1000、1:2000、1:4000和1:8000，100ul/孔，37℃恒温孵育1h，洗板四次；再加入羊抗兔酶标二抗，稀释比例为1:10000、1:20000和1:30000，100ul/孔，37℃避光孵育20min、40min和1h后，洗板四次；再加入TMB显色液100ul/孔，37℃避光孵育20min后，加入终止液50ul/孔，立即检测OD450nm吸光度值；同时，反过来将兔多抗作为捕获抗体分别稀释至1:1000、1:2000、1:4000，包被酶标板，不同稀释浓度1:1000、1:2000、1:4000和1:8000的单克隆抗体McAb-1作为检测抗体，进行同样实验；获取OD450值；根据以下标准曲线回归方程计算GRP78蛋白浓度；

y=0.263x - 1.114，

其中，y为OD450值，x为GRP78重组蛋白浓度的自然对数。