[发明专利]与棒状体相关蛋白的扩增引物及牛巴贝斯虫病检测试剂

权利要求书

1.扩增牛巴贝斯虫棒状体蛋白的引物对，其序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。

2.一种牛巴贝斯虫抗原重组蛋白的制备方法，其特征在于以牛巴贝斯虫基因组DNA为模板，以引物对SEQ ID No.1和SEQ ID No.2进行扩增，将扩增产物和原核表达载体双酶切后纯化回收酶切片段并进行连接，再转入大肠杆菌中诱导表达，表达产物经纯化后得到重组蛋白。

3.根据权利要求2所述的牛巴贝斯虫抗原重组蛋白的制备方法，其特征在于回收产物连接到pGEM-Teasy载体后转化到大肠杆菌感受态细胞Top10中，37℃过夜培养，挑取分布较独立的白色菌落于LB的培养液中37℃温箱摇菌，得到重组质粒pGEM-T EasyB.boRAP-1，再将重组质粒pGEM-T EasyB.boRAP-1与表达载体pET30a分别用限制性内切酶NdeI和HindIII双酶切，回收酶切片段，将目的片段和pGEM-pET30a的双酶切片段进行连接，得到重组载体pB.boRAP-1，将其转化到表达菌株Rosetta中进行诱导表达，上清通过亲和层析纯化得到牛巴贝斯虫棒状体重组蛋白。

4.一种可用于检测牛巴贝斯虫病抗体的试剂，其特征在于试剂中至少包括引物对SEQID No.1和SEQ ID No.2。

5.一种检测牛巴贝斯虫病抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于试剂盒中至少有：包被有用权利要求3的方法制备的重组抗原的酶标板，牛巴贝斯虫病标准阴性和阳性血清。

6.根据权利要求5所述的检测牛巴贝斯虫病抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于试剂盒内还有底物溶液、封闭液、样本稀释液、洗涤液、反应液、显色液和终止液。

7.权利要求5或6所述的检测牛巴贝斯虫病抗体的间接ELISA试剂盒的制备方法，其特征在于用碳酸盐缓冲液为包被液，在4℃的温度下包被13h，封闭液采用1％牛血清，在37℃的温度下封闭1.5h。

8.牛巴贝斯虫病标准阴性和阳性血清的制备方法，其特征在于抽取通过病原学显微镜镜检、分子生物学PCR检测和血清学检测均无任何梨形虫的牛犊血液制备得到阴性血清，再切除通过病原学显微镜镜检、分子生物学PCR检测和血清学检测均无任何梨形虫的牛犊的脾脏，术后十五天，皮下静脉注射牛巴贝斯虫虫体，注射后连续三天给受试牛肌肉注射地塞米松，抽取注射牛巴贝斯虫体后21日至40日间受试牛的不抗凝血制备阳性血清。