[发明专利]一种羰基还原酶突变体mut-AcCR(I147V/G152L)及其应用与编码基因

说明书

本发明提供一种羰基还原酶突变体mut‑AcCR(I147V/G152L)及其应用与编码基因。羰基还原酶AcCR能够催化多种潜手性羰基化合物不对称还原，但是其对于芳香族化合物的活性及底物耐受性较低，本发明采用酶分子改造手段将糖基化还原酶AcCR进行突变，获得突变体mut‑AcCR(I147V/G152L)，突变体对于2‑羟基苯乙酮的比酶活可达6.4 U/mg，比未突变前的羰基还原酶的比活力提高17.4倍。底物耐受浓度从50 mmol/L提高至200 mmol/L。本发明所述羰基还原酶突变体在羰基化合物的不对称还原中被广泛应用。

技术领域

本发明属于酶分子改造领域，具体涉及一种羰基还原酶突变体mut-AcCR(I144V/G152L)及其应用与编码该突变体的基因。

背景技术

光学纯的手性醇及其衍生物是合成手性药物、液晶材料、香精香料、农药的重要手性中间体，在医药及其他化工领域占有重要位置。手性醇可以通过化学法和和生物法合成。化学合成法一般需要高温高压等严苛的条件；采用大量的有机试剂，环境污染严重；制备过程复杂，往往存在多次保护和去保护步骤；更重要的是化学方法得到的产物的对映体选择性低。相比于化学法，生物法一般在常温常压下反应，条件温和，设备要求低，环境污染小，底物专一性强，具有较高的立体选择性和区域选择性，产物对映体纯度高等优点。生物催化合成手性醇正在以强劲的势头在制备药物中间体中发挥越来越重要的作用。基于绿色化学和可持续发展的原则，生物催化制备手性醇是既绿色又可持续的合成途径。

羰基还原酶作为一种高效、高选择性的可用于不对称还原反应的生物催化剂，常用于制备具有光学活性的手性化合物。羰基还原酶在催化不对称还原反应时存在两个极具挑战性的问题，并且限制其进一步应用于不对称合成反应。第一，很多高价值手性醇的潜手性底物的溶解性很低或不可溶于酶的天然介质。这个缺点可以通过采用非水介质提高底物溶解度的方法得以解决，如采用有机溶剂、离子液体、超临界二氧化碳等单或双相反应介质进行生物催化反应。一部分羰基还原酶以这些溶剂为介质，在高底物浓度时亦表现出较高的酶活。但是，一些羰基还原酶的活性、选择性和稳定性在非水介质中往往会出现不同程度的降低。因此，在选择羰基还原酶非水反应介质时需要对反应介质进行筛选。第二，由于羰基还原酶具有严格的底物特异性、辅酶依赖性以及生理环境的不适应等特点，使羰基还原酶并非总能有效地完成一个特定的立体专一性合成反应，如在高浓度底物、高温、极端pH等环境下，羰基还原酶往往表现出活性低、选择性和稳定性差等不足。

随着基因组学和蛋白质组学的发展，科学家将更多的目光投入到蛋白质工程上。以定向进化和理性设计等为基础，对蛋白序列进行修饰，改变其结构，进而影响其催化性能，使其具有更好的区域和立体选择性、更高的稳定性和底物耐受性，为手性醇的合成提供更有效的方式。将蛋白质工程更好地应用于酶分子改造，可以使以酶或细胞为主导的生物催化在底物、介质、反应器等其他方面得到进一步的发展，使蛋白质工程取得的成果得到更有效、更持续性地应用。

本课题组前期研究中，从醋酸杆菌Acetobacter sp.CCTCC M209061中克隆表达一种羰基还原酶。该羰基还原酶能够催化多种底物进行不对称还原反应，具有良好的立体选择性。但是，该羰基还原酶对于2-羟基苯乙酮等羰基化合物的酶活较低，对于这类底物的耐受性比较差，只有在底物浓度较低时才能达到良好的催化效果。

发明内容

为了克服该酶活力低及底物耐受性差的缺点，本发明的首要目的在于提供一种活性和底物耐受性有明显提高的遵循反-Prelog规则的羰基还原酶突变体mut-AcCR(I147V/G152L)。

本发明的另一个目的在于提供上述羰基还原酶突变体mut-AcCR(I147V/G152L)的基因及氨基酸序列。

本发明的再一个目的在于提供上述羰基还原酶突变体mut-AcCR(I147V/G152L)的应用。

本发明的目的通过以下技术方案实现。