[发明专利]福寿螺金属硫蛋白基因cds及其克隆方法和表达方法

权利要求书

1.一种福寿螺金属硫蛋白基因cds，该基因的核苷酸序列为：

2.权利要求1所述的福寿螺金属硫蛋白基因cds的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)MTLP基因的cds的扩增

上游引物为5’-CCGGAATTCATGTCTTCTTCCGAAGCAC-3’，引入EcorI酶切位点和保护碱基ccg，下游引物为5’-CCCAAGCTTTCACTTGCAAGAACACTTGC-3’，引入了HindIII酶切位点和保护碱基ccc；以福寿螺肝胰腺组织总RNA反转录获得cDNA为模板，进行PCR扩增。

3.根据权利要求2所述的福寿螺金属硫蛋白基因cds的克隆方法，其特征在于，在步骤(1)中，PCR扩增的条件为94℃预变性3分钟，94℃30s，58℃30s，72℃1min，35个循环，72℃7min，产物用柱式PCR产物纯化试剂盒纯化。

4.根据权利要求3所述的福寿螺金属硫蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)puc19-MTLP克隆重组质粒的构建

使用EcorⅠ，HindⅢ内切酶双酶切puc19质粒和PCR纯化产物，将双酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，对目的条带进行切胶回收，并用T4DNA连接酶重组连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经氨苄青霉素和蓝白斑筛选，挑取白色菌落进行PCR和双酶切鉴定，将阳性克隆进行测序；

(2)pet28a(+)-MTLP表达重组质粒的构建

使用EcorⅠ，HindⅢ内切酶双酶切puc19-MTLP重组质粒和pet28a(+)质粒，将双酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，对目的条带进行切胶回收，并用T4DNA连接酶重组连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，双酶切和PCR筛选阳性克隆，提取质粒再转化大肠杆菌BL2(DE3)感受态细胞，PCR和双酶切鉴定，将阳性克隆进行测序以确定对码情况；

(3)目的基因MTLP的表达

获得的含有正确重组子的工程菌BL21(DE3)接种含有50ug/ml卡那霉素的LB液体培养基摇床过夜培养；再以1％接种量接种到新的含有50ug/ml卡那霉素的LB液体培养基20℃摇床3h培养至OD600为0.4-0.6，添加IPTG至终浓度0.9mM，继续20℃诱导培养4h，12000rpm离心5min收集菌体沉淀，加2×SDS凝胶上样缓冲液，混匀后沸水浴10min，SDS—PAGE电泳分析表达产物。

5.根据权利要求4所述的福寿螺金属硫蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达方法，其特征在于，获得的福寿螺金属硫蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中表达的蛋白分子大小为13kD。

6.对权利要求4所述的福寿螺金属硫蛋白基因cds的表达验证方法，包括以下步骤：

(1)MTLP的cds扩增结果

从福寿螺肝胰腺组织总RNA反转录获得的cDNA中获得300bp左右的DNA片段；

(2)puc19-MTLP克隆重组质粒的构建

菌液PCR扩增，获得300bp左右的DNA片段；用EcorⅠ，HindⅢ双酶切鉴定，获得300bp和2700bp左右两条特异条带，去除puc19部分，M13通用引物测序显示MTLP基因的cds其核苷酸序列如下：

(3)pet28a(+)-MTLP表达重组质粒的构建

菌液PCR扩增，获得300bp左右的DNA片段；用EcorⅠ，HindⅢ酶切，获得300bp和5000bp左右两条特异条带，去除pet28a(+)部分，用T7通用引物测序结果同上述MTLP基因的cds测序结果相同，插入方向和对码均正确，可表达出87个氨基酸，序列如下：