[发明专利]一种苦荞抗氧化肽及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种制备苦荞抗氧化肽的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

S1、苦荞清蛋白粉末的制备方法

向苦荞粉中加入正己烷搅拌脱脂，脱脂后进行固液分离，重复以上搅拌脱脂和固液分离操作步骤三次，得到脱脂苦荞粉，将脱脂苦荞粉和去离子水按照质量比为1:10的比例混合搅拌，搅拌提取2h后在温度为4℃、转速为6000r/min的条件下离心15 min，离心后取上清液，用1M 的盐酸调节上清液的pH值至4.5，沉淀后得到上清液蛋白，再用去离子水冲洗所述上清液蛋白2次，然后用0.1M的NaOH溶液调节所述上清液蛋白的pH值至7.0，在-20℃的温度条件下冷冻干燥24h，得到苦荞清蛋白粉末；四次搅拌脱脂的时间共48h，所述正己烷的每次的加入体积与所述苦荞粉的质量之比为1mL: 1 g；

S2、苦荞清蛋白酶解肽的制备方法

将S1得到的苦荞清蛋白粉末和去离子水混合溶解，得到浓度为30mg/mL的苦荞清蛋白溶液，用1mol/L的 NaOH溶液调节pH值至9.0，加入碱性蛋白酶，在45℃的恒温震荡水浴锅中酶解4h，置于沸水浴中10min，在温度为4℃、转速为6000r/min的条件下离心10 min，离心后取上清液，在-20℃的温度条件下冷冻干燥24h，得到苦荞清蛋白酶解肽，命名为TBAH；所述水浴锅的震荡速率为100rpm；所述碱性蛋白酶的加入量为所述苦荞清蛋白粉末质量的4%；

S3、苦荞抗氧化肽的制备方法

S301、超滤：首先用截留分子量为3kDa和10kDa的超滤管对TBAH进行超滤分离后，得到MW≤3k Da，10k Da＞MW＞3k Da和MW≥10kDa的三个重均分子量的多肽组分，分别命名为TBAH-Ⅰ、TBAH-Ⅱ和TBAH-Ⅲ均在-20℃的温度条件冷冻干燥；所述MW为重均分子量；

S302、阴离子交换色谱法：在S301中得到的三种不同重均分子量的多肽组分中选取抗氧化活性最佳的多肽组分TBAH-Ⅰ，用去离子水溶解至浓度为50mg/mL，取4mL，用DEAE-52纤维素阴离子交换色谱柱进行分离，依次用去离子水、0.1mol/L、0.5mol/L和1mol/L的 NaCl溶液进行阶段洗脱，流速为1.0 mL/min，收集到多管洗脱液，每管收集的洗脱液均在280nm下测定吸光度，收集合并后得到5个洗脱组分，分别命名为Fr.1、Fr.2、Fr.3、 Fr.4 和Fr.5，均在-20℃的温度条件冷冻干燥24h；

S303、葡聚糖凝胶色谱法：在S302中得到5个洗脱组分中选取抗氧化活性最佳的洗脱组分Fr.2，用去离子水溶解至浓度为40mg/mL，取1mL，用G15葡聚糖凝胶色谱柱进行分离，用去离子水进行洗脱，流速为1.0 mL/min，收集到多管洗脱液，每管收集的洗脱液均在280nm下测定吸光度，收集合并后得到3个洗脱组分，分别命名为Fr.2-1、Fr.2-2 和 Fr.2-3，均在-20℃的温度条件冷冻干燥24h；

S304、RP-HPLC反向高效液相色谱法：在S303得到3个洗脱组分中选取S303中抗氧化活性最佳的洗脱组分，采用RP-HPLC 反相高效液相色谱进行分离，色谱柱为C₁₈柱，流动相为第一混合液+第二混合液，进行线性洗脱，所述第一混合液由水和三氟乙酸混合而成，所述第二混合液由乙腈和三氟乙酸混合而成，所述第一混合液和第二混合液中的三氟乙酸的体积含量均为0.1%；线性洗脱的条件为：洗脱时间30min，自第二混合液占流动相的体积比为0%开始，至60%结束洗脱，流速为0.8mL/min，检测波长为280nm，分离纯化得到苦荞抗氧化肽，即苦荞抗氧化肽P1、苦荞抗氧化肽P2和苦荞抗氧化肽P3；

S305、利用蛋白质/多肽测序仪对苦荞抗氧化肽的氨基酸测序，利用电喷雾电离源耦合的质谱仪对苦荞抗氧化肽的分子量检测；

所述苦荞抗氧化肽的数量为3个，分别命名为苦荞抗氧化肽P1、苦荞抗氧化肽P2和苦荞抗氧化肽P3，所述苦荞抗氧化肽P1的氨基酸序列为Gly-Glu-Val-Pro-Trp，分子量为587.0Da；所述苦荞抗氧化肽P2的氨基酸序列为Tyr-Met-Glu-Asn-Phe，分子量为702.8Da；所述苦荞抗氧化肽P3的氨基酸序列为Ala-Phe-Tyr-Arg-Trp，分子量为741.8Da。

2.根据权利要求1所述的一种制备苦荞抗氧化肽的方法，其特征在于，S302-S304中所述抗氧化活性的测定方法为羟基自由基清除活性测定。