[发明专利]一种利用基因编辑技术敲入终止子实现可转录元件敲除的方法

说明书

本发明涉及一种利用基因编辑技术，敲入终止子实现可转录元件(包括蛋白编码基因和非编码基因等)高效敲除的方法。具体的，在拟敲除基因的转录起始位点(TSS)后通过基因编辑技术造成DNA断裂，同时在细胞中导入含有转录终止序列(终止子)的DNA供体，该供体不含目的基因同源序列，后者也通过基因编辑技术在细胞内线性化，使得终止子通过非同源修复途径被敲入到目的基因TSS之后，使得目的基因的内源性转录提前终止，实现目的基因的敲除。该方法应用范围广，所有可被转录的元件都可以通过该方法敲除。供体DNA具有通用性，效率高，且可包含抗性基因，效率高，有一定的实用价值。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种更高效，应用范围更广泛(包括非编码RNA)的基于基因编辑技术的基因敲除方法。

背景技术

基因敲除(knockout)是一种遗传工程技术，通过在基因组层面对生物的遗传物质改变，令特定的基因丧失功能，在研究实践中，往往通过目的基因的敲除观察和检测对生物体造成的影响，从而推测出该基因功能。是功能基因组研究的重要工具，也为一些疾病的治疗，工具生物的改进提供强大的技术支持。

传统的基因敲除建立在胚胎干细胞技术和基因同源重组技术基础上的一种分子生物学技术，效率比较低。基因编辑对生物医学研究的影响不亚于30年前的PCR。基因编辑技术的出现为我们敲除基因提供了更好的策略。近年来，锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应子(TALEN)和规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)已经掀起了一浪又一浪的基因编辑高潮。尤其是CRISPR技术，由于其简单有效，被认为是近年出现的革命性的基因编辑技术。该技术可以快速，容易的实现对目标DNA序列在精确的位点进行编辑，包括突变，修改，插入等改变，因此，基于CRISPR技术的基因敲除目前有广泛的应用。CRISPR(clusteredregularly interspaced short palindromic repeats)即成簇规律间隔短回文重复，是存在于细菌基因组中的DNA序列，Cas(CRISPR associated)即CRISPR相关基因，有多种类型，Cas9是其中一种。在以Cas9作为核酸内切酶的情况下，通过向细胞内导入gRNA和Cas9蛋白实现对目标DNA的切割。gRNA是一个经过特殊设计的向导RNA，可以识别并结合靶基因DNA序列，Cas9蛋白是一个酶，可以与gRNA以及其识别的DNA结合，将目的DNA序列切断，再利用细胞DNA的损伤修复机制，实现对DNA在断裂位点及附近进行突变，插入，替换等等修改，实现基因编辑的目的。因此CRISPR系统常被比作一把可定点切割DNA的“魔剪”。(参见文献:Mali,P.,Yang,L.,Esvelt,K.M.,Aach,J.,Guell,M.,DiCarlo,J.E.,Norville,J.E.,andChurch,G.M.(2013).RNA-guided human genome engineering via Cas9.Science 339,823-826)。

在其最常应用的场景中，CRISPR系统被用于蛋白编码基因的敲除。因为只需要利用CRISPR系统在蛋白编码基因的编码区(Sequence coding for aminoacids in protein，CDS)起始位置“剪一刀”，即产生一个DNA双链断裂(Double Strand Break,DSB)，此时DNA主要通过非同源末端连接(Non-homologous End Joining-NHEJ)的方式修复，会导致切割位点的插入或缺失突变(Indel)，因此，该基因在表达成蛋白时，大概率会出现框移突变，使得正确的蛋白不能表达，从而实现基因的功能敲除。但是，CRISPR介导的DSB有一定的效率，实际操作中需要把导入CRISPR个元素的细胞分成单细胞培养，一个一个挑克隆进行下一步的鉴定，工作量非常大。而且，如果该策略只能在CDS区域切割DNA才有效，而设计gRNA必须满足很多条件，比如有PAM(protospacer adjacent motif)序列，无脱靶位点等，使得有的基因的CDS区并不能设计gRNA，使得该策略的应用范围降低。