[发明专利]一种新的提取噬菌体基因组DNA的方法

权利要求书

1.一种新的噬菌体基因组DNA的提取方法，其特征在于：浓缩噬菌体颗粒步骤中，去除细胞碎片，去除宿主菌的核酸物质，加入PEG6000使噬菌体沉降，TM缓冲液重悬噬菌体；直接采用尿素变性剂分离噬菌体基因组DNA；通过琼脂糖凝胶电泳的方法，将噬菌体基因组DNA与蛋白及其他杂质分开；采用低温冷冻含基因组DNA的凝胶，室温融化后过滤获得噬菌体基因组DNA溶液。

2.根据权利要求1所述的新的噬菌体基因组DNA的提取方法，其特征在于：所述尿素终浓度为2-5M。

3.根据权利要求1所述的新的噬菌体基因组DNA的提取方法，其特征在于：所述噬菌体为对氯仿敏感的噬菌体基因组DNA的提取。

4.根据权利要求1所述的新的噬菌体基因组DNA的提取方法，其特征在于：所述对氯仿敏感的噬菌体包括铜绿假单胞菌噬菌体和金黄色葡萄球菌噬菌体Z-1。

5.根据权利要求1所述的新的噬菌体基因组DNA的提取方法，其特征在于：具体方法如下：

(1)噬菌体的扩增：过夜培养宿主菌，体积百分比2％接种于新鲜LB培养基中，按照最佳MOI加入噬菌体，适宜温度振荡培养至宿主菌完全裂解；

(2)宿主菌细胞碎片及基因组的去除：裂解液加入NaCl至终浓度为0.1M，混匀溶解后冰浴1h，10000r/m，离心20min，取上清加入DNase I和RNase A至终浓度为2.5μg/mL,混匀，37℃静置1h；

(3)噬菌体的浓缩：继续加入PEG6000至终浓度为10％，充分振荡溶解后，置于4℃，过夜，10000r/m，离心20min，弃去上清，用1/50体积的TM缓冲液将沉淀重悬，不使用氯仿抽提直接加入DNase I和RNase A，终浓度为10μg/mL，37℃静置1h；

(4)宿主菌基因组的去除：加入DNase I和RNase A，终浓度为10μg/mL，37℃静置1h；

(5)噬菌体外壳蛋白的变性：将重悬液与10M尿素等体积混合后，通过琼脂糖凝胶电泳，将噬菌体基因组和蛋白及其他杂质分开；

(6)噬菌体基因组的回收：紫外灯下切除含有目的基因的胶条，用滤纸吸尽凝胶琼脂表面的液体，尽量减少不含目的基因的凝胶量，尽量切碎凝胶，置于1.5mL离心管中，-80℃放置20min，室温融化，10000r/m离心10min，将上层液和下层凝胶全部通过0.22μm的滤膜,收集滤液，滤液中加入等体积苯酚氯仿异戊醇＝25:24:1体积比，抽提1-2次，最后用等体积氯仿抽提一次，取上清；

(7)噬菌体基因组的保存：上清中加入1/10体积的NaAc和2倍体积的95％乙醇，混匀，-20℃静置2h后，10000r/m，离心10min，弃去上清，沉淀加入200μL 70％乙醇，10000r/m离心5min，重复洗涤两次后，置于室温干燥，加入50μLddH₂O，置于-20℃保存。