[发明专利]一种新型海洋生物污染检测标志物

权利要求书

1.细胞色素P450酶CYP450，其特征在于：其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

2.一种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求1所述的细胞色素P450酶CYP450的蛋白质。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

4.如权利要求1-3任一项所述的细胞色素P450酶CYP450的克隆方法，包括：样品准备、总RNA的提取、cDNA第一链的合成、核心序列的克隆、全长序列的克隆、筛选和生物信息学分析，其特征在于：细胞色素P450酶CYP450核心序列的克隆中的PCR反应的扩用引物为：

CYP450 01F：5′-GGGCTTCTTGCGAAACGC-3′，

CYP450 01R：5′-CCTCCTGGGAGGTTACGATGACC-3′。

5.根据权利要求4所述的细胞色素P450酶CYP450的克隆方法，其特征在于包括：

(一)样品准备：准备厚壳贻贝、DEPC水、DEPC处理水、75％乙醇；

(二)总RNA的提取：选取性成熟、活力较强的厚壳贻贝提取总RNA，检验纯度及其完整性；

(三)cDNA第一链的合成：利用厚壳贻贝组织提取的总RNA进行cDNA第一条链合成；

(四)核心序列的克隆：以上述cDNA为模板，以CYP450 01F和CYP450 01R为简并引物，用Taq DNA聚合酶(TaKaRa)进行PCR扩增；

(五)全长序列的克隆：分别设计引物扩增3′RACE和5′RACE未知片段，将3′端、5′端和核心片段序列进行拼接；

(六)筛选：将步骤(五)获得的产物连接至pMD18-T载体并转至DH5感受态细胞中单克隆培养，菌液PCR验证后进行测序获得CYP450全序列；

(七)生物信息学分析：厚壳贻贝细胞色素P450酶CYP450cDNA片段大小为1476bp，共编码491个氨基酸。

6.如权利要求5所述的细胞色素P450酶CYP450的克隆方法，其特征在于：所述扩增3′RACE未知片段的特异性引物是：

3′-CYP450-outter：TGTCCTGTGCTATTAATCCCCTGACTTTC和

3′-CYP450-inner：AATGTATCCACTTACAGAAGGACCA。

7.根据权利要求5所述的细胞色素P450酶CYP450的克隆方法，其特征在于：所述扩增5′RACE未知片段的特异性引物是：

5′-CYP450-outter：CTGCCACCACGGTGTTATGC和

5′-CYP450-inner：CGGCTAATATGGCTACACTG。

8.一种基于权利要求1-7任一项所述的细胞色素P450酶CYP450的新型海洋生物污染检测标志物，其特征在于：以厚壳贻贝作为检测海洋污染的生物样本，以厚壳贻贝细胞色素P450酶CYP450用作海洋污染的检测标记物。

9.一种利用权利要求8所述的新型海洋生物污染检测标记物检测海洋生物污染的方法，其特征在于包括：通过对受到污染区域厚壳贻贝的解剖提取消化腺和腮中的RNA，反转录成DNA，再利用荧光定量技术检测细胞色素P450酶CYP450在消化腺和腮中的相对表达量，即可。

10.细胞色素P450酶CYP450用作新型海洋生物污染检测标记物在海洋污染检测中的应用。