[发明专利]定量检测鸡马立克氏病毒Meq基因缺失疫苗株和野毒株的荧光定量PCR试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种定量检测鸡马立克氏病毒Meq基因缺失疫苗株和野毒株的荧光定量PCR试剂盒及其应用。所述的试剂盒中含有两套分别用于检测鸡马立克氏病毒Meq基因缺失疫苗株和野毒株的荧光定量PCR引物和探针，其中用于检测鸡马立克氏病毒Meq基因缺失疫苗株的荧光定量PCR引物序列如SEQ ID NO.1以及SEQ ID NO.2所示，探针序列如SEQ ID NO.3所示；用于检测鸡马立克氏病毒野毒株的荧光定量PCR引物序列如SEQ ID NO.4以及SEQ ID NO.5所示，探针序列如SEQ ID NO.6所示。经过体外实验证明本发明的试剂盒敏感性高，特异型好，重复性好，能分别准确定量鸡马立克氏病毒Meq基因缺失疫苗株和MDV野毒株，对于鸡马立克氏病的诊断、疫苗的免疫监控等具有重要意义。

技术领域

本发明涉及一种荧光定量PCR试剂盒及其应用，特别涉及一种定量检测鸡马立克氏病毒Meq基因缺失疫苗株和野毒株的荧光定量PCR试剂盒及其应用。本发明属于生物医药技术领域。

背景技术

鸡的马立克氏病(Marek’s Disease，MD)是鸡的一种重要病毒性传染病，病原为鸡马立克氏病病毒(Marek’s Disease virus，MDV)。MD流行病学研究证实我国的MDV野毒株持续发生变异，向更强的毒力方向进化，现地已经出现能够突破现有MD疫苗(CVI988株、814株)保护的MDV强毒株。

针对MDV毒力不断增强、严重危害养禽业发展的状况，我国学者通过基因重组技术，缺失MDV流行毒株的主要毒力基因-Meq基因，研发了具有更高免疫效力的鸡马立克氏病病毒Meq基因缺失疫苗株(rMSΔMeq株，该毒株记载在公开号为CN102363769B，发明名称为“鸡马立克氏病毒Meq基因缺失疫苗株，其构建方法及应用”的专利申请中，其微生物保藏编号是：CGMCC No.4612)，该疫苗株对MDV变异毒株能提供良好的疫苗保护作用。MD疫苗抗肿瘤但不能阻止野毒株的感染，野毒株可以和疫苗毒株共存于体内，并且可以排放到环境中，而鸡体内疫苗毒株和野毒株的分别定量对于该病的诊断、疫苗的免疫监控等具有重要意义。目前尚没有一种有效的、准确的区分MDV基因缺失疫苗和野毒株的荧光定量方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可定量检测鸡马立克氏病毒Meq基因缺失疫苗株和野毒株的荧光定量PCR试剂盒。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明的一种定量检测鸡马立克氏病毒Meq基因缺失疫苗株和野毒株的荧光定量PCR试剂盒，含有两套分别用于检测鸡马立克氏病毒Meq基因缺失疫苗株和野毒株的荧光定量PCR引物和探针，其中用于检测鸡马立克氏病毒Meq基因缺失疫苗株的荧光定量PCR引物序列如SEQ ID NO.1以及SEQ ID NO.2所示，探针序列如SEQ ID NO.3所示；用于检测鸡马立克氏病毒野毒株的荧光定量PCR引物序列如SEQ ID NO.4以及SEQ ID NO.5所示，探针序列如SEQ ID NO.6所示，所述的探针的5’端标记有报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

其中，优选的，所述的试剂盒中还包括用于扩增作为内参的鸡的管家基因卵铁转蛋白基因(ovo)的引物和探针。

其中，优选的，所述的用于扩增作为内参的鸡的管家基因卵铁转蛋白基因(ovo)的引物序列如SEQ ID NO.7以及SEQ ID NO.8所示，探针序列如SEQ ID NO.9所示，所述的探针的5’端标记有报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

其中，优选的，所述的试剂盒中还包括Ex Taq DNA聚合酶，10×Ex Taq缓冲液、dNTP混合物以及阳性标准品。

其中，优选的，所述的阳性标准品包括分别含有鸡马立克氏病毒Meq基因缺失疫苗株和野毒株片段的质粒，所述的质粒是用上述的引物从鸡马立克氏病毒Meq基因缺失疫苗株和野毒株上分别扩增出各自的片段连接到pMD18T载体上得到的。