[发明专利]一种蛋白质标签载体的构建及其表达与检测方法

权利要求书

1.一种蛋白质标签载体pattB-act5cP-nosMLExon-GFP的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）果蝇nos基因3'UTR-AS序列的扩增，得nos 3'UTR-AS，且其碱基序列为SEQ IDNO.1；

（2）pattB-nosP-3'UTR-AS过渡载体的构建：将步骤（1）得到的PCR产物纯化后和pattB-nosP载体用限制性内切酶进行酶切反应，然后再用T4连接酶将nos3'UTR-AS序列插入到pattB-nosP质粒中；

（3）act5c基因ATG上游4550 bp序列的扩增，得扩增后的碱基序列为SEQ ID NO.2；

（4）pattB-act5cP-3'UTR-AS过渡载体的构建：将步骤（3）得到的PCR产物纯化后和pattB-nosP-3'UTR-AS载体用限制性内切酶进行酶切反应，再用T4连接酶将act5cP4.55k片段插入到pattB-nosP-3'UTR-AS质粒中；

（5）nosE3D-I3-E4C和GFP序列的扩增，其中GFP的碱基序列为SEQ ID NO.3；

（6）nosE3D-I3-E4C-GFP序列的扩增；

（7）蛋白质标签载体pattB-act5cP-nosMLExon-GFP载体的构建：将nosE3D-I3-E4C-GFP序列插入到pattB-act5cP-3'UTR-AS质粒中，其中nosMLExon的碱基序列为SEQ ID NO.4。

2. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述3'UTR-AS序列为果蝇nos基因末位外显子3'非翻译区序列3'UTR，及其下游100 bp附加序列AS。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（2）在构建过程中，需要在nos3'UTR-AS中带上限制性内切酶Sbf1、Kpn1、Asc1、Not1和Xba1的酶切位点，且Kpn1、Asc1和Not1为预埋酶切位点，其中，Sbf1也可换为Age1。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（3）为以野生型果蝇的基因为模板进行扩增。

5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（6）采用搭桥法扩增，即设计两对引物，先分别扩增nosE3D-I3-E4C和GFP，再以nosE3D-I3-E4C和GFP为模板，利用两模板之间的重叠部分搭桥扩增，一次插入载体中。

6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（6）采用搭桥法扩增，在nosE3D-I3-E4C和GFP中分别引入限制性酶切位点，分别插入过渡载体进行扩增。

7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（5）中nosE3D-I3-E4C序列的扩增无TAG终止密码子，扩增GFP序列时在其3'端引入TAG终止密码子。

8.一种蛋白质标签载体的表达方法，其特征在于，将采用权利要求1-7任一所述方法制备的蛋白质标签载体的编码基因显微注射入果蝇的卵中，然后挑选出红眼转基因果蝇，建立转基因果蝇品系。

9.一种蛋白质标签载体检测方法，其特征在于，取权利要求8建立的转基因果蝇的卵巢和精巢，进行免疫荧光染色，进行GFP的表达检测。