[发明专利]一种通过遗传改造提高裂殖壶藻ATCC20888油脂和DHA含量的方法

说明书

本发明公开一种通过遗传改造获得高油脂和DHA含量的裂殖壶藻ATCC20888突变藻种的方法。包含如下步骤：（1）过表达来源于隐甲藻的苹果酸酶提高裂殖壶藻ATCC20888还原力，获得高产油脂的突变藻种；（2）以上一步获得的藻种为出发藻种，过表达来源于高山被孢霉菌的延长酶，将十六碳转化为十八碳，解除对乙酰辅酶A羧化酶的抑制作用，提高前体供给，进一步提高油脂含量的同时，提高DHA占细胞干重的比例。利用本发明的方法对裂殖壶藻藻种进行遗传改造，获得的裂殖壶藻突变藻种与出发藻种相比，油脂占细胞干重比例提高48.63%，其含量达到藻体干重的71.68%；DHA占细胞干重比例提高38.69%，其含量达到藻体干重的26.70%。

技术领域

本发明公开一种通过遗传改造获得高油脂和DHA含量的裂殖壶藻ATCC20888突变藻种的方法，具体涉及一种高油脂和DHA含量的工程藻株的获得方法及应用。属于工业微生物领域。

背景技术

二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid，DHA）是人体自身不能合成，但对人体健康非常有利的一种必需脂肪酸，近年来一直是科学研究的热点。临床试验表明，DHA是神经系统细胞生长及维持的一种主要成分，是大脑和视网膜的重要构成成分，在人体大脑皮层中含量高达20%，在眼睛视网膜中所占比例最大，约占50%，因此， 对于婴幼儿神经系统和视力发育起到非常重要的作用，同时还具有防止心血管疾病发生和抗炎、抗肿瘤等作用。据报道，荷兰DSM公司每年至少销售2000吨DHA，销售总额近3.17亿美元，因此具有非常广阔的市场应用前景。

DHA的来源主要是海洋鱼类，由于海洋鱼类体内会积累大量重金属和有机污染物，对人体极为不健康，因此近年来，在寻找可持续的、高品质的DHA替代来源上已作了许多工作。其中，利用海洋微藻异养发酵生产DHA已被视为一个主要的替代方法。裂殖壶藻（Schizochytrium）是一种富含DHA的微藻种属，也是目前在DHA发酵生产中使用最为广泛的藻株。裂殖壶藻在DHA生产方面的优势是：生长速度较快，最终生物量较高，DHA得率相对较高，国际上报道最高值为培养90-100小时，藻体干重200 g/L，DHA 40-45 g/L，目前国内许多单位筛选获得优良的裂殖壶藻藻种，实现了高密度发酵及中试扩大试验，推动整个行业的快速发展。

目前，实际裂殖壶藻发酵过程中生产应用的裂殖壶藻存在油脂及DHA含量偏低的问题。在发酵过程中藻种的性状很容易发生退化。因此，利用有效的技术手段对裂殖壶藻进行改造，获得高产且遗传稳定的优良菌种对促进裂殖壶藻生产DHA产业的可持续发展是十分重要的。

据报道，藻体中NADPH的一个重要来源是苹果酸酶。据报道，通过向培养隐甲藻的培养基中添加苹果酸酶抑制剂抑制苹果酸酶的活力，油脂产量显著下降，说明来源于隐甲藻的苹果酸酶在油脂合成方面起到非常重要的作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高裂殖壶藻油脂和DHA含量的方法。本发明提供了一种通过过表达关键位点酶，提高其活性，快速获得性状优良的裂殖壶藻藻种的方法。

本发明通过遗传改造获得高油脂和DHA含量的裂殖壶藻ATCC20888突变藻种的方法，其具体步骤包括：

1.从隐甲藻cDNA中扩增苹果酸酶基因，从p1301质粒中扩增CaMV35s 启动子和CaMV poly(A)终止子，组成表达盒后，与新霉素抗性基因表达盒融合，组成苹果酸酶基因转化表达盒。

2.在富集培养基中培养裂殖壶藻ATCC20888，选取指数期的种子，利用氧化锆研磨菌体，然后分别利用2%海盐和50 mM 蔗糖洗涤细胞，将10 μL苹果酸酶基因转化表达盒（500 ng /μl）加入100 μL处理过的细胞中，利用电穿孔将DNA送入细胞，电转条件：2000V场强和50 μF电容，200Ω电阻下电穿孔。0.6mL富集培养基中加入电转后细胞，并在25℃和180rpm下培养12小时。