[发明专利]一种蔗糖水解酶突变体及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种蔗糖水解酶，属于基因工程和酶工程领域。本发明对来源于Xanthomonas axonopodis pv.glycines、Janthinobacterium agaricidamnosum NBRC 102515、Caulobacter crescentus NA1000 CB15的蔗糖水解酶进行改造，分别对其第271位或第279位或第281位的丝氨酸残基进行定点突变，获得的单突变体酶的转苷活性较野生型蔗糖水解酶升高。这一发明有助于对于糖苷水解酶转苷和水解机理的研究，亦可应用于糖苷水解酶工业生产多聚糖。

技术领域

本发明涉及一种蔗糖水解酶突变体及其制备方法与应用，属于基因工程和酶工程领域。

背景技术

蔗糖水解酶(SH,EC 3.2.1.–)，属于GH13糖苷水解酶家族，是一个很强的水解酶。几乎没有转苷能力，可将蔗糖分子几乎等比例地水解为葡萄糖和果糖分子。蔗糖水解酶含有5个结构域(A、B、B'、C和N)，其中A、B和B'-结构域构成了蔗糖水解酶的催化核心。

现有的蔗糖水解酶大多水解能力很强，转苷能力相对比较弱。研究水解和转苷的决定机制一直是一个热门的话题。目前，已经有许多关于水解和转苷的报道，但大多集中在供体和受体位点，能够显著改变水解和转苷平衡的的方法目前报道的还很少。因此，本发明通过单点突变即显著提高了蔗糖水解酶的转苷能力，说明此位点对蔗糖水解酶的水解和转苷作用很重要。进而该位点可以为其他糖苷水解酶的水解和转苷的改造提供参考和借鉴。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题是提供一种蔗糖水解酶的突变体，对Caulobacter crescentus NA1000 CB15来源的蔗糖水解酶的第271位丝氨酸进行突变；

或，对Janthinobacterium agaricidamnosum NBRC 102515来源的蔗糖水解酶的第279位丝氨酸进行突变；

或，对Xanthomonas axonopodis pv.glycines来源的蔗糖水解酶的第281位丝氨酸进行突变；

上述突变位点与蔗糖水解酶的转苷作用和水解作用相关。

在本发明的一种实施方式中，所述来源于Caulobacter crescentus NA1000 CB15蔗糖水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述来源于Janthinobacteriumagaricidamnosum NBRC 102515蔗糖水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述来源于Xanthomonas axonopodis pv.glycines蔗糖水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在本发明的一种实施方式中，所述突变是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的第271位丝氨酸残基变为丙氨酸残基，突变体命名为S271A；

或，所述突变是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的第279的丝氨酸残基变为丙氨酸残基，突变体命名为S279A；

或，所述突变是将氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的第281的丝氨酸残基变为丙氨酸残基，突变体命名为S281A。

编码所述蔗糖水解酶突变体的基因。

携带所述蔗糖水解酶突变体的基因的载体。

携带所述蔗糖水解酶突变体的基因的重组细胞。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种蔗糖水解酶的突变体的制备方法，包括如下步骤：

(1)在蔗糖水解酶氨基酸序列的基础上确定突变位点；设计定点突变的突变引物，以携带蔗糖水解酶基因的载体为模板进行定点突变；构建含突变体的质粒载体；

(2)将突变体质粒转化进宿主细胞；