[发明专利]一株枯草芽孢基因工程菌及其在制备小分子透明质酸中的应用

说明书

本发明公开了一株枯草芽孢基因工程菌及其在制备小分子透明质酸中的应用，属于生物工程技术领域。本发明将硫酸软骨素AC裂解酶进行异源表达，选取信号肽amyQ，采用自行构建的pHA03载体，通过乳糖或异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导，实现了硫酸软骨素AC裂解酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达，并通过设计的硫酸软骨素AC裂解酶‑酶膜反应器实现了小分子透明质酸的高效连续生产。本发明以食品级枯草芽孢杆菌作为宿主菌株，安全可靠，为工业化绿色生产小分子透明质酸提供了有效的参考与借鉴，同时节能减排，经济效益和社会效益显著。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株产硫酸软骨素AC裂解酶的枯草芽孢基因工程菌及其在制备小分子透明质酸中的应用。

背景技术

透明质酸(Hyaluronic acid，HA)，又名玻尿酸，是Meyer和Palmer于1934年首先从牛眼玻璃体中分离出的一种高粘性物质。透明质酸是一种由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基-D-葡萄糖胺通过β-(1,3)糖苷键连接而成的双糖重复结构单位组成的线性多糖；每个双糖单位通过件β-(1,4)糖苷键与另一个双糖单位连接起来；其双糖单位可达25000个之多，分子量在20000～50000kDa之间。

透明质酸具有高度粘弹性和可塑性，超强的持水性和渗透性以及良好的生物相容性，被广泛应用于医学、药物、化妆品和食品等领域。透明质酸的粘弹性在关节腔内所起到的润滑、缓冲势作用及在结缔组织中充当填料的生物学功能之外，它还通过作用于细胞及细胞间质中的透明质酸受体，调节细胞功能，在组织生成和修复、肿瘤侵袭等过程中发挥重要作用。

目前工业生产透明质酸的方法通常包括组织提取和微生物发酵等，虽然工艺不同，但透明质酸分子量一般为20000～50000kDa，此类透明质酸因分子量较大，人体吸收及生物利用度较低，严重影响了透明质酸的疗效。因此，制备小分子透明质酸具有重要意义。

小分子透明质酸的制备方法有物理降解法、化学降解法和酶解法。物理法主要为加热、机械剪切、超声波破碎和、γ-射线辐照等，可促使透明质酸发生降解。虽然物理降解法处理过程简单，产品易于回收，但是存在一定的缺陷，例如加热法易使产品变色，超声效率较低，γ-射线辐照残留，且产品的稳定性差、分子量范围较大。化学降解方法有水解法和氧化降解法，水解法包括酸水解和碱水解，氧化降解常用的氧化剂为次氯酸钠和过氧化氢。但是，化学降解法引入了化学试剂，反应条件复杂，易给产品的生物活性带来影响和产品的纯化带来困难，且产生大量的工业废水。而酶法降解由于其反应条件温和、便于检测以及生物活性保持较好等特点，成为近年来小分子透明质酸的研究热点。

硫酸软骨素裂解酶(Chondroitinase,ChSase)是一类能将透明质酸降解为不饱和二糖及寡糖的裂解酶。根据其作用底物的不同分为ChSase AC,ChSase AC,ChSase AC和ChSase C。硫酸软骨素裂解酶产生菌如表1所示，其中肝素黄杆菌Flavobacteriumheparinum是ChSase AC的主要来源。

表1硫酸软骨素裂解酶产生菌

目前，虽然ChSase AC重组菌已经构建，但是仅仅得到少量的可溶性蛋白，大多的ChSase AC以包涵体的形式存在。此外，小分子量透明质酸一般用于医药和食品领域，而大肠杆菌表达的ChSase AC并不适用于小分子量透明质酸的制备。国内对于ChSase AC的发酵生产主要的问题是：发酵生产ChSase AC酶活偏低，且多为胞内表达，而破碎过程必定会增加生产成本。因此，构建以分泌型生产ChSase AC的菌株具有更重要的经济、社会和环境意义。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是，提供一株产硫酸软骨素AC裂解酶的基因工程菌及其构建方法，实现硫酸软骨素AC裂解酶的分泌表达，以解决现有技术中硫酸软骨素AC裂解酶表达量少、酶活低、存在包涵体等问题。