[发明专利]一种基于微孔阵列芯片的单细胞基因检测方法

权利要求书

1.一种基于微孔阵列芯片的单细胞基因检测方法，用于非疾病的诊断和治疗，其特征在于，包括以下步骤：

1）提供一种微孔阵列芯片，所述微孔阵列芯片由玻璃基底和聚甲基硅氧烷芯片键合而成，所述聚甲基硅氧烷芯片包括微孔阵列和包围在所述微孔阵列外侧的外围沟道，所述微孔阵列包含26208个微孔单元；

2）将细胞悬液滴加于所述微孔阵列芯片上，通过28g，5min离心操作使细胞沉降于所述微孔阵列芯片的各个微孔中，实现单细胞在单个微孔单元中的定位，所述细胞悬液是用10%FBS-PBS溶液重悬的体外培养细胞或者血液细胞；

3）在所述微孔阵列芯片上粘贴PCR封装膜，进行第一次封装，通过336g，5min离心操作甩掉多余的溶液，然后在恒温箱内75~85℃高温加热7min使细胞膜蛋白变性失活，反应结束后，立即将微孔阵列芯片移入4℃冰箱冷却10 min，揭掉PCR封装膜；

4）在所述微孔阵列芯片上滴加10 μL PCR预混液，然后采用聚丙烯双面胶膜粘贴所述微孔阵列芯片，通过336g，5min离心操作甩掉多余的溶液，然后再利用紫外光固化胶将玻璃盖板与所述微孔阵列芯片上的聚丙烯双面胶膜上层贴合，实现第二次封装；

5）50℃孵育30min，然后将第二次封装完成的微孔阵列芯片放置在PCR原位仪上进行PCR，反应结束后，显微镜下观察荧光信号，分析单细胞基因表达水平，实现了单细胞捕获、裂解、核酸扩增和信号读取功能一体化；其中，所述步骤2）中细胞悬液中的细胞总个数少于所述微孔阵列芯片上微孔单元数量的十分之一，保证经过离心操作之后单个微孔单元中最多落入一个细胞；所述聚甲基硅氧烷芯片由经过PEG-（6-9）-硅氧烷处理过的聚甲基硅氧烷材料制成，表面表现为强亲水性，表面接触角≤20°；

所述聚甲基硅氧烷芯片的厚度为0.2 mm~1 mm，所述外围沟道的宽度为150 μm~250 μm，高度为50 μm~60 μm；所述微孔直径为20 μm~50 μm，高度为50 μm~60 μm，同一行每相邻两个微孔之间的间距为30 μm ~60 μm，相邻行中的一个微孔位于上一行与该微孔距离最近的两微孔中心的中轴线上。

2.根据权利要求1所述的单细胞基因检测方法，其特征在于，所述步骤2）、3）、4）中的离心操作均通过匀胶机进行。

3.根据权利要求1所述的单细胞基因检测方法，其特征在于，所述PCR预混液包含Taqman DNA聚合酶、dNTP、Taqman水解探针、Mg²⁺、0.2%Tween以及上、下游引物。

4.根据权利要求3所述的单细胞基因检测方法，其特征在于，所述Taqman水解探针是针对待测细胞中的特定基因序列设计的修饰有荧光基团和猝灭基团的特定序列。

5.根据权利要求1所述的单细胞基因检测方法，其特征在于，所述步骤4）中利用紫外光固化胶将玻璃盖板与所述微孔阵列芯片上的聚丙烯双面胶膜上层进行贴合时，涂覆紫外光固化胶之后，在所述微孔阵列芯片的微孔阵列部分上方覆盖一张铝箔纸，进行紫外灯照射使紫外光固化胶完全固化。