[发明专利]一种无两性电解质自由流等电聚焦电泳分离方法

说明书

本申请公开了一种无两性电解质自由流等电聚焦电泳分离方法，第一步：使用驱动泵将运行流动相泵入自由流电泳装置的分离腔内,并保持流动相稳定运行；第二步：使用电极液循环泵将电极液储罐中的正极电极液泵入自由流电泳装置的正极室中并保持电极液循环，将电极液储罐中的负极电极液泵入自由流电泳装置的负极室中并保持电极液循环；第三步：在两个电极施加电压，调节电压至适当值，并保持装置稳定运行，使其在分离腔的后部，电极间自动形成稳定的pH梯度。本申请的优势在于：方法简单易行，所需试剂价格低廉，不会对分离后样品检测产生影响。

技术领域

本发明涉及自由流电泳分离技术领域，具体的说，是一种无两性电解质自由流等电聚焦电泳分离方法。

背景技术

蛋白质是生命活动的物质基础，种类繁多，功能多样。其是由氨基酸通过酰胺键连接成的、具有特定结构和功能的生物大分子。它能够执行各种各样的生物学功能，使DNA中蕴藏的信息得以显现。蛋白质是生命活动最直接的体现者，只有蛋白质组的研究才能从根本上阐释生命过程。而蛋白质的分离技术是蛋白质组研究的基础。但由于蛋白质自身所具有的特殊性质，很难使用常规的分离技术进行有效的分离。

自由流电泳是一种连续的全液相分离技术，其装置由两块距离很近的平行板组成一个薄的分离腔。运行流动相从分离腔中流过，形成稳定的层流。样品通过进样口进入分离腔后，被液流驱动流向出口端。同时通过对装置中纵向流动的液体层流加载一个正交的横向电场，使层流中的带电荷样品在电场力的作用下按照不同的电泳淌度发生不同程度的横向偏移，从而达到分离的效果。自由流电泳分离过程中样品连续进入，无固体支持介质，且分离环境温和，特别适用于蛋白质等生物样品的分离制备。曹成喜课题组在2013年研制了一种带有冷却系统的易操作的稳定自由流电泳装置，大大的提升了自由流电泳装置的可操作性。自由流电泳能够与其他电泳技术相结合，充分利用其他电泳技术的优点，使得自由流电泳能够在更多的领域发挥作用。最常见的几种分离模式分别是自由流区带电泳、自由流等电聚焦、自由流等速电泳、自由流电场梯度电泳等。曹成喜课题组在2017年开发了一种移动反应界面自由流电泳方法，用于蛋白质的连续浓缩。自由流等电聚焦电泳在常见的自由流电泳分离模式中具有最高的分辨率，所以常常被用于较难分离样品的分离。曹成喜课题组在2017年使用循环自由流等电聚焦装置成功的制备了内源性线粒体。该方法使用一系列具有pH梯度的高浓度两性电解质作为运行流动相，在循环自由流等电聚焦装置中建立了pH梯度来对样品进行分离。等电聚焦是20世纪60年代出现的一种主要用于蛋白质分离的手段。由于其具有较高的分辨率，所以得到快速的发展。它的基本原理是利用各种蛋白质样品的等电点不同，在一个连续的线性pH梯度中进行蛋白质的分离分析。等电聚焦的过程是一个样品聚焦的过程，因此其条带扩散问题较小，可同时达到分离和浓缩的目的。在传统的自由流等电聚焦电泳过程中，需要特定的两性电解质缓冲溶液来建立pH梯度。但两性电解质溶液不但昂贵，且可能会与部分样品产生相互作用，影响紫外检测的灵敏度。当分离后的组分需要接质谱检测时，必须通过复杂的手段将这些两性电解质去除。因此不使用两性电解质缓冲溶液进行自由流等电聚焦电泳将会是一种理想的操作方法。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本申请提供了一种无两性电解质自由流等电聚焦电泳分离方法。

本申请采用的技术方案是：

一种无两性电解质自由流等电聚焦电泳分离方法，其具体步骤为：

第一步：使用驱动泵将运行流动相泵入自由流电泳装置的分离腔内,并保持流动相稳定运行；

第二步：使用电极液循环泵将电极液储罐中的正极电极液泵入自由流电泳装置的正极室中并保持电极液循环，将电极液储罐中的负极电极液泵入自由流电泳装置的负极室中并保持电极液循环；

第三步：在两个电极施加电压，调节电压至适当值，并保持装置稳定运行，使其在分离腔的后部，电极间自动形成稳定的pH梯度。