[发明专利]检测加热不燃烧卷烟总粒相物对细胞早期凋亡率影响方法

说明书

本发明公开检测加热不燃烧卷烟总粒相物对细胞早期凋亡率影响方法，包括以下步骤：(1)样品前处理；(2)人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的制备；(3)人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的细胞浓度计算；(4)人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的接种；(5)受试物暴露；(6)收集细胞；(7)细胞早期凋亡率的测定。本发明样品的有效处理、检测剂量的优化设定以及靶细胞的正确选择，使得本方法能够准确检测加热不燃烧卷烟总粒相物对细胞早期凋亡率的影响。

技术领域

本发明属于烟草制品的安全性生物学效应评价技术领域，特别涉及检测加热不燃烧卷烟总粒相物对细胞早期凋亡率影响方法。

背景技术

细胞凋亡的概念是1972年由Kerr等三位科学家首次提出，虽然细胞凋亡(apoptosis)与细胞坏死(necrosis)的最终结果极为相似，但它们的过程与表现却有很大差别。细胞凋亡是一个主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，它并不是病理条件下自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。对于传统卷烟细胞毒性的检测，国际烟草科学研究合作中心CORESTA组织推荐采用中性红细胞毒性法，但中性红细胞毒性法存在一定的缺陷。中性红进入细胞并在细胞内聚集的过程要求有完整的细胞膜，而细胞凋亡早期细胞膜表面发生改变，带负电荷的磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS暴露在细胞膜外表面。因此，有必要开发一种用于检测加热不燃烧卷烟制品对细胞早期凋亡率影响的方法，作为加热不燃烧卷烟制品细胞毒性检测的补充，以区别加热不燃烧卷烟总粒相物对细胞坏死和细胞凋亡的影响。

烟草监管立法的日趋严格以及吸烟与健康研究的深入，导致了烟草公司寻求风险更低、无环境烟气的新型烟草制品。加热非燃烧型卷烟，其特征在于加热烟草而非燃烧烟草，向消费者提供一定的烟草特征感受。加热不燃烧卷烟制品避免了传统卷烟制品燃烧时产生的复杂混合物所带来的危害，现阶段已成为国外烟草公司从传统卷烟制品转向的新方向之一。

检测对象的改变导致样品的前处理方法、检测用细胞、检测剂量等出现很大差异，这些差异会对试验结果的准确性产生较大影响，现有的用于检测卷烟烟气对细胞早期凋亡率影响的方法已经不能满足加热不燃烧卷烟制品对细胞早期凋亡率影响的检测需要。目前，国内外研究机构及烟草公司尚未有针对加热不燃烧卷烟制品对细胞早期凋亡率影响的检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测加热不燃烧卷烟总粒相物对细胞早期凋亡率影响的方法，其以加热不燃烧卷烟总粒相物作为检测基础，为准确评价加热不燃烧卷烟制品对安全性评估提供有效测定方法。

除非另有说明，本发明所采用的百分数均为体积百分数。

本发明中所使用的RPMI1640细胞培养基购买于市场任何可购买到的商品公司。

检测加热不燃烧卷烟总粒相物对细胞早期凋亡率影响方法，包括以下步骤：

(1)样品前处理：采用直线型吸烟机，在抽吸容量为55.0mL，持续时间3s，抽吸频率为30s的抽吸条件下，连续抽吸10口，用直径为44mm的剑桥滤片捕集，分别于抽吸前、抽吸后称量烟气捕集器的质量，按照公式(1)计算加热不燃烧卷烟总粒相物的质量mTPM；

mTPM＝m₁-m₀ (1)

式中：

m₀——抽吸前烟气捕集器的质量，单位为毫克(mg)；

m₁——抽吸后烟气捕集器的质量，单位为毫克(mg)；

捕集完毕后，将捕集后的剑桥滤片放入50mL的三角瓶中，加入二甲基亚砜，使加热不燃烧卷烟总粒相物在二甲基亚砜中的浓度为40mg/mL；将此三角瓶置于超声仪上超声30min；再用无菌滤纸过滤收集二甲基亚砜萃取液，分装至1mL的冻存管中，-80℃保存待用；