[发明专利]一种敲除酿酒酵母菌HO基因的方法

说明书

本发明公开了一种敲除酿酒酵母HO基因的方法，以酿酒酵母单倍体菌株为出发菌株，将基因敲除片段转化酿酒酵母单倍体菌株，G418抗性筛选获得阳性转化子，将含有Cre重组酶基因的质粒转化HO基因敲除的单倍体菌株，利用半乳糖诱导Cre重组酶表达，使kanMX抗性基因丢失，得到抗性基因丢失的重组菌，再通过连续培养丢失质粒，既得到敲除HO基因的酿酒酵母菌株。本发明可快速、高效地分离获得不含外来抗性基因的工业酿酒酵母单倍体，具有工艺简单、单倍体分离率高、敲除成功率高的优点。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种敲除酿酒酵母菌HO基因的方法。

背景技术

工业酿酒酵母菌株大多数是来自于自然界或发酵产品中分离而来，野生型的菌株多为二倍体，其复杂的倍性给酵母改良、代谢工程改造和遗传研究带来了诸多困难，由于多倍体菌株缺少营养缺陷型等筛选标记，增加了改造难度，而以单倍体形式存在的酿酒酵母基因信息简单明了，因此，一般先将二倍体或多倍体菌株通过生孢拆分获得单倍体菌株，筛选出性状优良利于后期分子改造、基因功能探索的单倍体菌株。综上可见，单倍体的筛选分离是极为关键的一步。

现有研究表明，酿酒酵母的HO基因能表达一种内切酶，在酵母生长过程中将导致单倍体配型(a型或α型)转换，从而与周围的异型孢子结合恢复为二倍体。现有技术一般直接通过同源重组技术敲除双倍体酿酒酵母HO基因，筛选阳性转化子，然后利用转化菌株生孢、蜗牛酶酶解以及YPD平板分离来获得单倍体。

但是对多倍体酿酒酵母HO基因双敲难度大，难以获得完全沉默HO基因的多倍体酿酒酵母，而HO基因单敲除的酿酒酵母的单倍体分离成功率低；单一的蜗牛酶酶解效率低，孢子释放率低；释放出的孢子粘连情况严重，导致单倍体分离率较低。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一种敲除酿酒酵母HO基因的方法，以解决现有技术中多倍体酿酒酵母HO基因双敲难度大，难以获得完全沉默HO基因的多倍体酿酒酵母的问题。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种敲除酿酒酵母菌HO基因的方法，包括如下步骤：

(1)筛选酿酒酵母单倍体菌株；

(2)将基因敲除片段转化酿酒酵母单倍体菌株，利用G418抗性筛选获得阳性转化子，所述基因敲除片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示；

(3)将含有Cre重组酶基因的质粒转化步骤(2)中的阳性转化子，利用半乳糖诱导质粒中Cre重组酶表达，使抗性基因丢失，得到抗性基因丢失的重组菌，连续培养，使含有Cre重组酶基因的质粒丢失，即得到敲除HO基因的无抗性的酿酒酵母单倍体菌株。

其中，筛选酿酒酵母单倍体菌株的方法如下：

将酿酒酵母涂布在产孢培养基上，30℃培养5～7d，取酵母菌泥经混合酶酶解破壁处理，超声处理，超声功率为12～60W，时间为5～20min；再将其稀释10³～10⁶倍，涂布于YPD培养基，PCR筛选酿酒酵母单倍体菌株。

其中，所述混合酶为蜗牛酶与纤维素酶的混合物，其中，蜗牛酶的含量为1～1010mg/ml，纤维素酶的含量为1～100mg/ml。

其中，所述含有Cre重组酶基因的质粒为pSH65。

有益效果：

本发明公开了一种敲除酿酒酵母菌HO基因的方法可快速、高效地分离获得不含外来抗性基因的工业酿酒酵母单倍体，具有工艺简单、单倍体分离率高、敲除成功率高的优点。

附图说明