[发明专利]整合双拷贝功能性F4菌毛操纵子基因猪源益生菌EP1克隆株、构建方法及应用

说明书

本发明涉及到生物技术领域，具体涉及整合双拷贝功能性F4菌毛操纵子基因猪源益生菌EP1克隆株、构建方法及应用，包括如下步骤：pTargetT‑maeB::P_tetF4和pTargetT‑nth/tppB::P_tetF4重组质粒的构建；通过整合双拷贝功能性F4菌毛操纵子基因的益生菌克隆株的构建，得到无抗性的双拷贝F4菌毛基因整合克隆株。该益生菌克隆株作为益生菌活疫苗候选株和仔猪断奶后腹泻和水肿病的治疗用药物。相对于现有技术，本发明的有益效果为：猪源益生菌NY10(EP1)，无抗性基因的存在；该重组菌能够有效提高对猪肠道传代上皮细胞的粘附性能；体外细胞感染抑制实验表明，预孵育重组菌和IPEC‑J2细胞可竞争抑制F4菌毛阳性大肠杆菌病原3030‑2对IPEC‑J2细胞的感染并显著降低其黏附数量。

技术领域

本发明涉及到生物技术应用领域，具体涉及到大肠杆菌的染色体稳定遗传表达外源功能性F4菌毛蛋白。

背景技术

大肠杆菌NY10(EP1)是由本实验室上世纪50年代从腹泻严重的猪场中无腹泻猪只粪便中分离出的对猪腹泻病有很好预防作用，是一种猪源性大肠杆菌益生菌，该大肠杆菌益生菌对猪肠道有益生作用，至今并未发现对宿主有已知的不益影响，并且申请人实验室对该猪源大肠杆菌益生菌通过全基因组测序，分析验证了其益生菌的基因背景。

为了实现微生物中同源或异源蛋白或化合物的过量表达生产，大多利用质粒的过表达，这种方法易于操作和调控的表达而被广泛使用，但存在遗传不稳定性。质粒的复制，抗生素抗性基因，过量表达以及其他异源基因等问题所带来的代谢负担会导致宿主细胞耗尽，产量损失甚至导致宿主细胞原始功能丧失。此外，为了维持细菌细胞中质粒的存在，须使用抗生素或其他选择性药剂，这增加了整个生物加工的成本，同时也增加了耐药基因传播的几率。近年来，细菌染色体表达同源或异源基因在合成生物学和生物医学中越来越受青睐。

在细菌染色体组整合同源或外源的DNA基因分子，常用的分子生物学方法包括使用转座子、噬菌体、、核酸内切酶以及重组酶系统，常规的分子生物学方法在细菌染色体整合基因上具有一定的优势，但也都存在着自身的局限性，如长片段基因难以整合，效率低，脱靶率高等。本专利所使用的方法为CRISPR/cas9双质粒系统对益生菌NY10(EP1)染色体进行外源大片段DNA基因片段(F4菌毛操纵子编码基因长约8Kb)的整合。

仔猪断奶后腹泻(PWD)为养猪业临床上常见的疾病，主要病原菌为F4菌毛阳性产肠毒素大肠杆菌ETEC，通过菌毛黏附、定植易感仔猪后感染发病，导致仔猪高死亡率，体重降低，生长缓慢，药物治疗费用昂贵等。临床上防治该疾病主要运用抗生素治疗，但随着养殖业生产中耐药菌的产生和累积，急需研究新的防控措施。本专利所构建的多种重组益生菌NY10(EP1)稳定携带遗传表达F4菌毛，有望为断奶仔猪腹泻的防控提供新思路和策略。

发明内容

为了克服上述缺陷，本发明为利用益生菌NY10(EP1)无质粒克隆菌NY10(EP1)菌株染色体中非必需基因(maeB和nth/tppB)内的位点整合并稳定表达双拷贝F4(K88)菌毛，有望作为抗仔猪断奶后腹泻益生菌活性疫苗候选株。

为了实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：整合双拷贝功能性F4菌毛操纵子基因猪源益生菌EP1克隆株，其特征在于，该益生菌克隆株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2018.7.2，保藏编号为CGMCC No.16048。

整合双拷贝功能性F4菌毛操纵子基因猪源益生菌EP1克隆株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)pTargetT-maeB::P_tetF4和pTargetT-nth/tppB::P_tetF4重组质粒的构建；