[发明专利]一种新型双发射荧光染料探针及其制备与应用

说明书

本发明涉及双发射荧光染料探针及其制备方法和应用，该探针的结构式如下式I所示：该探针是以双侧异佛尔酮丙二腈为骨架，2,4‑二硝基苯磺酰基作生物硫醇识别位点。与现有技术相比，它的独特之处在于该探针实现了生物硫醇的比率型检测，而不是传统的off‑on型，且成功地进行了活细胞中生物硫醇的荧光共聚焦成像。

技术领域

本发明属于小分子荧光探针领域，涉及一种比率型生物巯基荧光探针及其制备方法与应用，尤其是涉及一种基于异氟尔酮丙二腈结构的比率型荧光探针及其制备方法与应用。

背景技术

生物硫醇广泛存在于细胞或生物体中，包括半胱氨酸(Cys)，谷胱甘肽(GSH)和高半胱氨酸(Hcy)。它们是通过维持微环境氧化还原稳态来调节细胞功能的关键因素。因此生物硫醇的异常水平将导致许多疾病。例如，GSH作为最丰富的细胞内硫醇(1-10mM)在内源性抗氧化活性中起重要作用，并且GSH水平降低可能与艾滋病，癌症和许多神经系统疾病有关，Cys缺乏可导致疾病例如儿童生长缓慢、皮肤病变和虚弱，以及Hcy是心脏病和阿尔茨海默病的危险因素。因此，检测和量化生物系统中的硫醇是越来越重要的。

小分子荧光探针是一种生物传感器，具有灵敏度高，方便，成本低，无侵入等优点，能够在生命系统中实时检测，操作简单。因此，荧光探测已成为各种检测技术中最方便的方法之一。比率荧光法是通过测量两种不同波长处荧光强度的比值测定目标物的一种分析方法。由于所测得的荧光比值信号能够极大地降低光源强度波动和仪器稳定性变化的影响，从而赋予该方法更高的灵敏度和准确度，因此比率荧光探针的构建引起研究者的广泛关注，已开发出大量用于检测生物硫醇的荧光探针，大多都是Turn-ON型的荧光探针，例如具有蓝色发光的香豆素，具有绿色发光的荧光素，具有绿色或黄色发光的萘酰亚胺，等等，他们大多都是只具有单一波长信号。因此开发具有双发射的荧光染料任然具有较大的意义。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种双发射荧光染料探针及其制备与应用。该探针为以DNBS(2,4-二硝基苯磺酰基)为生物巯基的识别基团，双边异氟尔酮丙二腈为荧光团骨架的一种比率型荧光探针，本发明的荧光染料可以应用于活细胞染色。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种双发射荧光染料探针，其特征在于，该探针的结构式如下式I所示：

一种双发射荧光染料探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将异氟尔酮、丙二腈和催化剂加入有机溶剂中，在氮气保护下回流反应10～20h，冷却，将反应液倒入冰水中，析出固体，过滤，得白色固体异氟尔酮丙二腈(式Ⅳ)；

(2)将步骤(1)所得异氟尔酮丙二腈与4-羟基间苯二甲醛，以及哌啶加入无水乙醇中，在氮气保护下回流反应2～6h，冷却，减压除去溶剂，用二氯甲烷进行柱层析得到橙红色固体(式Ⅵ)；

(3)将2,4-二硝基苯磺酰氯、步骤(2)所得式Ⅵ化合物和三乙胺加入无水乙腈中，并将反应混合物在氮气保护下30～50℃反应0.2～1小时。通过TLC跟踪反应，有浅黄色固体析出，通过过滤，得到目标产物；

步骤(1)所述的催化剂包括哌啶，所述的有机溶剂包括乙醇。

步骤(1)所述异氟尔酮、丙二腈、催化剂和有机溶剂的摩尔比为1：(1～2)：(0.2～0.4)：(25～35)。

所述异氟尔酮、丙二腈、催化剂和有机溶剂的摩尔比优选1：1.5：0.35：32。

步骤(2)所述的异氟尔酮丙二腈与4-羟基间苯二甲醛的摩尔比为1：(1～3)；

所述的异氟尔酮丙二腈与哌啶的摩尔体积比为：1:(0.5～2)mmol/d；